外源粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子对牛体外胚胎发育的影响

发布时间：2017-06-25 08:09

  本文关键词：外源粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子对牛体外胚胎发育的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种多潜能造血生长因子,主要由T细胞和巨噬细胞产生,能诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体细胞呈集落性生长,促进多种细胞增殖、分化。研究表明,GM-CSF能够提高附植前体外胚胎发育的质量,提高移植后的妊娠率降低自然流产的发生。本文旨在探究外源GM-CSF对牛体外胚胎发育的影响和作用机制。为研究GM-CSF对附植前体外胚胎发育的影响,于卵母细胞受精后第5天在培养液中按梯度添加GM-CSF(0、1、10、20 ng/mL),两天后统计囊胚率,以筛选外源GM-CSF最适添加浓度。比较了最适添加浓度与对照组囊胚内源ROS水平、细胞总数和凋亡率的差异。采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)方法对胚胎发育、抗凋亡、细胞氧化还原平衡、细胞代谢(沃博格效应)相关基因的表达水平进行了检测,以揭示GM-CSF提高附植前胚胎发育能力的作用机制。试验结果显示：培养液中添10 ng/mL GM-CSF可以显著提高囊胚率(30.75%,P0.05)和囊胚细胞总数(86.6±4.22 vs.66.625±4.33,P0.05),显著降低囊胚细胞的内源性ROS水平(0.0865±0.0160 vs.0.1260±0.0156,P0.05),有降低囊胚细胞凋亡率的趋势但差异不显著(15.21%±1.44% vs. 17.60%±0.97%, P0.05).10 ng/mL GM-CSF可以较对照组显著提高囊胚抗凋亡基因Bcl-2,抗氧化基因(SOD-1、GPx4、Nrf2)的表达水平(P0.05)；显著下调KEAP-1的表达(P0.05)；相比于对照组,survivin及PCNA的表达量在处理组显著升高(P0.05)；参与调控细胞无氧糖酵解(沃博格效应)的基因(G6PD、PDK1、PGK1及LDHA)在10 ng/mL GM-CSF处理组的胚胎细胞中显著高表达(P0.05),对其他基因的表达水平没有显著影响。以上结果表明,GM-CSF能够明显提高牛体外胚胎的发育效率及胚胎质量,促进细胞增殖、降低细胞内氧化应激水平；GM-CSF可能通过PI3K/Akt及JAK/STAT5信号通路及下游信号分子HIF1α、Nrf2发挥抗凋亡、抗氧化及调控细胞生长的作用,并上调糖酵解水平加强细胞生物合成活动。
【关键词】：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 胚胎体外培养 ROS 沃博格效应 牛
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要8-9
• 前言9-10
• 第一章 文献综述10-21
• 1.1 动物胚胎体外生产技术10
• 1.2 肿瘤与胚胎的代谢相似性10-13
• 1.2.1 能量代谢11
• 1.2.2 葡萄糖代谢11-12
• 1.2.3 氨基酸代谢12-13
• 1.2.4 代谢调控方式的相似性13
• 1.3 集落刺激因子对生殖活动调控的研究进展13-16
• 1.3.1 生殖道中CSFs的分布13-14
• 1.3.2 集落刺激因子对生殖活动及功能的调控14-15
• 1.3.3 集落刺激因子的应用15-16
• 1.4 GM-CSF对哺乳动物附植前胚胎发育的影响16-19
• 1.4.1 GM-CSF作用于附植前的胚胎对其后期发育情况的影响17
• 1.4.2 GM-CSF对囊胚发育的调节17-18
• 1.4.3 GM-CSF参与胚胎细胞的抗凋亡作用18
• 1.4.4 GM-CSF对胚胎细胞多能性和分化的影响18-19
• 1.4.5 GM-CSF调控胚胎发育的性别差异19
• 1.4.6 GM-CSF影响胚胎发育(囊胚发育)的模型19
• 1.5 本研究的目的和意义19-21
• 第二章 不同浓度GM-CSF对胚胎发育能力的影响21-30
• 2.1 试验材料及仪器21-25
• 2.1.1 试验材料21
• 2.1.2 主要仪器设备21
• 2.1.3 主要药品及试剂21-22
• 2.1.4 主要试剂及培养液配制22-25
• 2.2 试验方法25-26
• 2.2.1 卵母细胞的采集25
• 2.2.2 成熟卵母细胞的体外受精25-26
• 2.2.3 胚胎体外培养26
• 2.2.4 试验设计26
• 2.2.5 数据统计26
• 2.3 试验结果26-28
• 不同浓度GM-CSF对牛体外培养胚胎发育(囊胚率)的影响26-28
• 2.4 讨论28-30
• 第三章 GM-CSF对牛胚胎内源ROS、囊胚细胞数及凋亡率的影响30-38
• 3.1 试验材料及仪器30
• 3.1.1 试验材料30
• 3.1.2 主要仪器设备30
• 3.1.3 主要药品及试剂30
• 3.1.4 主要溶液及培养液配制30
• 3.2 试验方法30-32
• 3.2.1 卵母细胞的采集30
• 3.2.2 成熟卵母细胞的体外受精30
• 3.2.3 胚胎体外培养30
• 3.2.4 胚胎内源性活性氧簇(ROS)检测30-31
• 3.2.5 TUNEL检测囊胚细胞凋亡水平及细胞总数31-32
• 3.2.6 试验设计32
• 3.2.7 数据统计32
• 3.3 试验结果32-35
• 3.3.1 GM-CSF对囊胚内源性ROS水平的影响32-34
• 3.3.2 GM-CSF对囊胚内细胞总数及凋亡率的影响34-35
• 3.4 讨论35-38
• 第四章 GM-CSF对牛囊胚相关基因转录水平表达量的影响38-51
• 4.1 试验材料及仪器38
• 4.1.1 试验材料38
• 4.1.2 主要仪器设备38
• 4.1.3 主要药品及试剂38
• 4.1.4 主要溶液及培养液配制38
• 4.2 试验方法38-43
• 4.2.1 卵母细胞的采集38
• 4.2.2 成熟卵母细胞的体外受精38
• 4.2.3 胚胎体外培养38
• 4.2.4 囊胚RNA提取及cDNA合成38-40
• 4.2.5 荧光定量PCR检测相关基因的表达40-43
• 4.3 试验结果43-47
• 4.3.1 样品总RNA提取及普通PCR检测43
• 4.3.2 qRT-PCR标准曲线的建立43-45
• 4.3.3 GM-CSF对囊胚基因表达水平的影响45-47
• 4.4 讨论47-51
• 第五章 全文结论51-52
• 后期研究设想52-53
• 参考文献53-62
• Abstract62-64
• 致谢64

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