毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的构建与筛选及3-1E基因的克隆表达

发布时间：2017-06-29 13:13

  本文关键词：毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的构建与筛选及3-1E基因的克隆表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鸡球虫病是由一种或数种艾美耳球虫寄生于鸡消化道上皮细胞内而引起的一种原虫寄生虫病,严重危害养鸡业。目前,球虫病的防治主要依赖化学药物或鸡球虫病活疫苗,虽然人们采取了穿梭用药、轮换用药、联合用药等各种措施,但球虫几乎对所有使用过的抗球虫药物均出现了耐药性。鸡球虫病活疫苗有着较强的免疫效果,但存在一些突出的问题,如有扩散病原的风险、疫苗接种剂量难以控制、影响饲料报酬等。因此,鸡球虫保护性抗原基因的筛选与克隆表达及其免疫保护力的研究一直是鸡球虫病研究的热点。毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)是鸡球虫病的重要病原,在临床上常危害8～18周龄的鸡,引起鸡的急性小肠球虫病。迄今,从毒害艾美耳球虫克隆的抗原基因甚少。为此,本研究应用SMART技术构建了毒害艾美耳球虫(E. necatrix)第二代裂殖子cDNA文库,并用免疫学方法从文库中筛选抗原基因,并对3-1E基因进行了克隆表达和免疫原性分析,为研究毒害艾美耳球虫亚单位疫苗奠定基础。1毒害艾美耳球虫第二代裂殖子的分离纯化28日龄无球虫雏鸡,每鸡经嗉囊感染20000个毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。感染150 h后扑杀、剖检鸡,刮取小肠中段肠黏膜组织,研磨后用1 mmol/L透明质酸酶消化,释放裂殖子；随后经4层棉纱布、260目锦纶筛兜和17 μm PET膜过滤,滤液经离心洗涤后用裂解液裂解红细胞；最后用30%和50%的Percoll,5200rpm离心15 min,分离纯化裂殖子。结果表明,该方法操作程序简单,分离效果好,获得的裂殖子无杂质,其纯度适用于分子生物学方面的研究。2毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的构建用Trizol试剂提取毒害艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA,用oliogo (dT)磁珠法纯化mRNA,随后采用SMART技术构建了毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA噬菌体表达文库。经鉴定,原始文库库容量2.14×106pfu/mL,扩增后的库容量约为4.47×1010pfu/mL,扩增后的文库重组率为90%：随机挑取100个单克隆,通过菌液PCR检测得知文库插入片段长度以400 bp～1000 bp为主。结果显示,构建的cDNA噬菌体表达文库达到SMART高质量文库指标。3毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的筛选首先,用毒害艾美耳球虫孢子化卵囊经嗉囊感染雏鸡,制备抗毒害艾美耳球虫的鸡康复血清；用纯化的毒害艾美耳球虫第二代裂殖子可溶性蛋白为抗原免疫小鼠,制备鼠抗毒害艾美耳球虫第二代裂殖子多抗血清；两种血清经ELISA检测,显示两种多抗均有很高的效价；随后,按试剂盒规定方法,用鸡康复血清和鼠抗代裂殖子血清对构建的cDNA文库进行免疫学筛选,经初筛分别获得出11个和7个阳性克隆,其中有5个克隆为双阳性；接着,对5个双阳性克隆进行复筛直至整个膜上均为阳性克隆为止；最后,对复筛后获得的阳性克隆进行PCR鉴定,其PCR产物送公司测序,对获得的EST序列进行生物信息学分析。结果显示,5个EST序列的长度分别为599、723、516、939和899bp,编码的蛋白分别与毒害艾美耳球虫假定蛋白,日本血吸虫SJCHGC02770蛋白、SJCHGC00839蛋白和SJCHGC 09095蛋白,柔嫩艾美耳球虫核糖体蛋白P2,毒害艾美耳球虫60S核糖体蛋白L8和柔嫩艾美耳球虫50S核糖体蛋白L2,以及巨型艾美耳球虫Ⅰ型细胞色素氧化酶有很高的同源性。4毒害艾美耳球虫第二代裂殖子3-1E基因的克隆表达首先,根据堆型艾美耳球虫子孢子3-1E基因序列设计引物,以毒害艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增基因片段；将目的片段插入到pGEM-T-Easy载体,常规转化大肠杆菌感受态细胞DH5a,蓝白斑筛选后对经酶切和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序。随后,根据3-1E基因的ORF序列和质粒pET-28a (+)酶切位点设计引物,以重组质粒pGEM-T-Easy-3-1E为模板扩增出表达片段,将该片段与载体pET-28a (+)连接,构建重组表达质粒pET-28a-3-1E,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。最后,分别以鼠抗重组蛋白多克隆抗体和毒害艾美耳球虫感染鸡康复血清为一抗进行Western-blot检测。结果显示,克隆的毒害艾美耳球虫3-1E基因全长为671 bp,具有一个大小为513 bp的完整开放阅读框,编码170个氨基酸；表达产物大小约为36.47 kDa,主要以可溶性形式存在；重组蛋白分别能被鼠抗重组蛋白多克隆抗体和鸡康复血清识别,显示重组蛋白具有免疫原性。
【关键词】：毒害艾美耳球虫 第二代裂殖子 cDNA文库 构建与筛选 3-1E基因 克隆 原核表达
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-9
• 符号说明9-11
• 前言11-12
• 第一篇 文献综述12-23
• 一、cDNA文库构建及其在鸡球虫研究中的应用12-17
• 1 cDNA文库的类型12-14
• 2 cDNA文库的构建方法14-16
• 3 cDNA文库在克隆鸡球虫基因中的应用16-17
• 二、鸡球虫病重组亚单位疫苗的研究进展17-19
• 1 TA4基因17-18
• 2 p250基因18
• 3 3-1E基因18
• 4 SO7基因18
• 5 EtMIC-2基因18-19
• 6 Mzp5-7基因19
• 参考文献19-23
• 第二篇 研究内容23-66
• 第一章 毒害艾美耳球虫第二代裂殖子的分离与纯化23-27
• 1 材料23-24
• 2 方法24
• 3 结果24-25
• 4 讨论25-26
• 参考文献26-27
• 第二章 毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的构建27-43
• 1 材料27-29
• 2 方法29-36
• 3 结果36-40
• 4 讨论40-41
• 参考文献41-43
• 第三章：毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的筛选43-54
• 1 材料43-44
• 2 方法44-48
• 3 结果48-52
• 4 讨论52-53
• 参考文献53-54
• 第四章 毒害艾美耳球虫第二代裂殖子3-1E基因的克隆表达与免疫原性分析54-66
• 1 材料54-55
• 2 方法55-58
• 3 结果58-63
• 4 讨论63-64
• 参考文献64-66
• 全文小结66-67
• 在读期间发表的论文67-68
• 致谢68-69

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本文编号：498007