组蛋白乙酰化对小鼠体外卵母细胞和胚胎发育的影响及早期胚胎组蛋白乙酰化模式的研究

发布时间：2017-06-29 17:02

  本文关键词：组蛋白乙酰化对小鼠体外卵母细胞和胚胎发育的影响及早期胚胎组蛋白乙酰化模式的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：组蛋白修饰作为表观遗传的一种主要方式,它在细胞分化、细胞癌变的发生、细胞多能性等诸多方面都有很好的诠释。组蛋白乙酰化是翻译后修饰最为重要的方式之一,它有助于基因转录起始及染色质的重塑。组蛋白乙酰化修饰在哺乳动物卵母细胞的成熟及早期胚胎发育尤为重要。然而,在哺乳动物中组蛋白乙酰化修饰在卵母细胞减数分裂和胚胎发育过程中的功能相关性研究却鲜有报道。本研究揭示了组蛋白乙酰化在小鼠卵母细胞减数分裂和小鼠早期胚胎发育过程中组蛋白乙酰化动态模式。(1)实验使用不同浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠,体外处理GV期卵母细胞14小时。结果发现,低浓度丁酸钠(0.1,0.5,1.0mM)处理下,卵母细胞成熟率没有显著差异,然而5.0mM和10.0mM NaBu处理下成熟率分别为为53.3±2.93%、30.2±0.05%VS 78.2±5.72%(对照组)。这些结果表明,丁酸钠具有抑制小鼠卵母细胞减数分裂恢复并以剂量依赖的方式发生。(2)为了进一步研究丁酸钠在卵母细胞减数分裂GV期至MI期的影响,卵母细胞在不含丁酸钠的培养液中培养3h后转入2.0mM丁酸钠5h,另一实验组在2.0mM丁酸钠体外培养8h。实验结果发现,空白对照组卵母细胞体外培养8h到第一次减数分裂中期,可检测到圆锥状纺锤体状牵引着染色体,染色体整齐的排列在赤道板位置。相比于实验组,染色体则混乱分布并呈凝集的状态,且伴随异常的纺锤体出现。同时我们利用免疫蛋白印迹方法检测MAPK磷酸化状态。实验结果显示ERK1/2和P-ERK1/2蛋白水平随丁酸钠处理时间增加而显著下调(P0.05)。利用免疫荧光技术分析并进一步确定小鼠体内胚、体外胚、孤雌胚组蛋白H3K9乙酰化动态模式。实验结果发现:在胚胎2-细胞与8-细胞阶段,体内胚、体外胚及孤雌胚组蛋白H3K9乙酰化水平没有显著差异。在胚胎4-细胞阶段,体内胚组蛋白H3K9乙酰化水平(0.76±0.27)显著高于孤雌胚(0.29±0.78)(P0.05)。桑葚胚和囊胚期,体外胚和孤雌胚组蛋白H3K9乙酰化水平明显低于体内胚(P0.05)。在8-细胞阶段,三种胚胎的组蛋白H3K9乙酰化均达到最低水平。以上的结果表明,小鼠的体内胚、体外胚及孤雌胚组蛋白H3K9乙酰化呈现动态变化的。本研究还评估了丁酸钠对体外受精胚胎发育率的影响。并且对组蛋白乙酰化调控基因HDAC1和多能性转录因子(Pou5f1,Sox2)mRNA表达进行了检测。(1)受精卵置于2.0mM NaBu的KSOM+AA培养液处理24h。相比于空白对照组发现,在卵裂率和桑葚胚率没有明显变化。然而在囊胚阶段,囊胚率显著高于空白对照组。(2)对于NaBu处理组,胚胎2-细胞时期体外胚胎HDAC1 mRNA、Pou5f1和Sox2mRNA水平显著升高(P0.05)。
【关键词】：卵母细胞 减数分裂 组蛋白乙酰化 小鼠胚胎
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S814
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 缩略词表11-12
• 第一章 文献综述12-20
• 1.1 卵母细胞发育12-13
• 1.2 表观遗传概述13-19
• 1.2.1 DNA甲基化13-15
• 1.2.2 组蛋白修饰与组蛋白密码15
• 1.2.3 组蛋白甲基化15-16
• 1.2.4 组蛋白乙酰化16-17
• 1.2.5 组蛋白磷酸化17-19
• 1.3 研究目的与意义19-20
• 第二章 组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对小鼠卵母细胞减数分裂的影响20-40
• 2 材料和实验方法20-40
• 2.1 实验动物20
• 2.2 实验主要仪器20-21
• 2.3 实验器材与药品及配制21-24
• 2.4 分子生物学软件及引物设计24-25
• 2.5 实验方法25-31
• 2.5.1 卵母细胞的获取体外培养25
• 2.5.2 卵母细胞免疫荧光检测25-26
• 2.5.3 卵母细胞荧光定量PCR26-29
• 2.5.4 卵母细胞的Western blot29-31
• 2.6 实验方案31-32
• 2.6.1 丁酸钠对小鼠卵母细胞发育的影响31
• 2.6.2 丁酸钠对卵母细胞减数分裂的影响31-32
• 2.6.3 丁酸钠对卵母细胞发育的 ERK/p-ERK 蛋白的影响32
• 2.7 实验结果32-38
• 2.7.1 丁酸钠对卵母细胞成熟的影响33-35
• 2.7.2 丁酸钠对卵母细胞 α-tubulin 蛋白的影响35-36
• 2.7.3 卵母细胞成熟发育过程中ERK与P-ERK蛋白的表达36-38
• 2.8 讨论38-39
• 2.9 小结39-40
• 第三章 小鼠早期胚胎发育过程组蛋白乙酰化模式和组蛋白去乙酰化酶抑制剂对胚胎发育的影响40-63
• 前言40
• 3 材料与方法40-63
• 3.1 实验动物40
• 3.2 实验主要仪器40-41
• 3.3 实验器材与药品试剂41
• 3.3.1 器材41
• 3.3.2 主要试剂41
• 3.4 实验方法41-45
• 3.4.1 小鼠成熟卵母细胞的获取41
• 3.4.2 小鼠体外受精（IVF）胚胎的获取41-42
• 3.4.3 小鼠孤雌胚胎的获取42-43
• 3.4.4 小鼠体内胚胎的获取43-44
• 3.4.5 小鼠卵母细胞发育和胚胎免疫荧光染色及荧光定量分析44
• 3.4.6 胚胎定量PT-PCR44
• 3.4.7 囊胚细胞染色计数44-45
• 3.5 实验设计45
• 3.5.1 小鼠卵母细胞发育及体内胚、体外受精胚、孤雌胚三种早期胚胎发育过程中组蛋白乙酰化动态模式及体内胚胎相关发育基因的RT-PCR45
• 3.5.2 丁酸钠对体外胚胎发育的影响及相关发育基因的 RT-PCR45
• 3.6 实验结果45-59
• 3.6.1 卵母细胞发育及早期胚胎发育过程中组蛋白乙酰化变化规律45-55
• 3.6.2 小鼠早期胚胎发育过程中相关基因的PT-PCR55-59
• 3.7 讨论59-62
• 3.7.1 组蛋白乙酰化修饰与卵母细胞成熟和胚胎发育59-60
• 3.7.2 表观遗传对胚胎发育多能性基因的调控60-62
• 3.8 小结62-63
• 创新与不足63-64
• 参考文献64-71
• 致谢71

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