姜黄素抑制单增李斯特菌溶血素活性的分子机制研究

发布时间：2017-07-01 08:10

  本文关键词：姜黄素抑制单增李斯特菌溶血素活性的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：单增李斯特菌是一种重要的兼性厌氧、人兽共患胞内寄生菌,是李斯特菌病的致病菌。单增李斯特菌主要感染老人、孕妇及免疫力低下的人。现阶段临床治疗单增李斯特菌感染疾病采用的是高剂量的抗生素疗法,然而,无论早期是否使用抗生素治疗,单增李斯特菌感染所引起的死亡率均高达30%。随着单增李斯特菌感染在全球范围内的不断爆发以及耐药性菌株的不断出现,使得单增李斯特菌感染成为严重的危害公共卫生的重要问题。作为胞内寄生菌,单增李斯特菌可分泌多种毒力因子介导细菌的细胞毒性。该病原菌可侵袭包括吞噬细胞及非吞噬细胞在内的多种细胞。内化进入细胞后,细菌从吞噬泡逃入细胞的胞浆内,利用其所分泌的毒力因子Actin A,招募宿主细胞的肌动蛋白(F-Actin)获得运动性并在胞浆内进行复制,随后感染邻近的细胞,在穿入邻近细胞的双层吞噬泡后,利用自身分泌的单增李斯特菌溶血素(Listeriolysin O,LLO)及PLCs(PIPLC及PCPLC),逃到吞噬泡外。值得一提的是,如果单增李斯特菌不能从吞噬泡内逃出,活化的巨噬细胞可以通过分泌ROS及NOS有效降解胞内的单增李斯特菌。单增李斯特菌逃入胞浆后又开始了下一轮的复制、感染。至此,单增李斯特菌就完成了其不暴露在宿主细胞外的生命循环。单增李斯特菌所分泌的LLO对其胞内的生存具有重要意义。多种研究表明,缺乏LLO,单增李斯特菌将被困在吞噬泡内,胞内增殖的单增李斯特菌数会显著降低。同样的与野生株相比,LLO敲除株感染小鼠的靶器官内的菌落定殖数显著低于野生株,几乎不会引起小鼠的死亡及组织损伤,LLO在单增李斯特菌感染中的重要作用使得该毒力因子成为抗单增李斯特菌感染的潜在药物靶点。在本篇文章中,我们应用溶血实验,筛选到了杨梅黄酮、黄芩素、桑色素、白杨素、柚皮素这5种黄酮类化合物可通过作用于LLO的第四结构域,影响LLO寡聚体形成而直接抑制其溶血活性。因为药物作用效果与其结构存在着紧密的联系,因此我们猜想是否有其他类型的化合物可通过不同的机制抑制LLO的成孔活性,通过筛选,我们发现酸性多酚类化合物姜黄素(Curcumin),也可以有效抑制LLO的溶血活性。对单增李斯特菌多引起的细胞死亡也有保护效果,我们对其抑制LLO溶血活性的机制进行了进一步研究。溶血的结果提示我们,姜黄素可以抑制LLO的成孔活性,因此在细胞中,很有可能可以抑制LLO从吞噬泡内的逃逸,减少胞内的单增李斯特菌数。胞内生长曲线的结果显示,姜黄素可以剂量依赖式降低胞内的单增李斯特菌数。我们使用免疫荧光染色的方法,分别用单增李斯特菌(MOI为2.5)与姜黄共同作用感染J774细胞,取0.5 h、3 h及5 h时进行固定、染色并观察。结果显示,在0.5 h时候,进入细胞内的单增李斯特菌数无显著差异,结果提示,姜黄素几乎不影响单增李斯特菌内化进入胞内。3 h固定染色结果发现,姜黄素可以显著降低逃逸的单增李斯特菌数,单增李斯特菌野生株EGD组的逃逸率为56.71%,溶血素敲除株EGDΔhly的逃逸率为0%,EGD+Curcumin组的逃逸率为23.94%。结果提示,姜黄素确实是通过抑制LLO的活性发挥保护作用的。在侵袭细胞5 h后,细菌已开始大量增殖逃逸,免疫荧光染色统计结果显示,姜黄素可以显著降低胞内的单增李斯特菌数目。使用PI和SYTO 9染色评价了巨噬细胞内单增李斯特菌的状态,结果显示,姜黄素处理后胞内活菌数由96.7%下降到37.29%,提示我们,姜黄素处理后有利于巨噬细胞杀死胞内的单增李斯特菌。姜黄素在小鼠感染单增李斯特菌模型中也显示出了良好的治疗效果。姜黄素处理后,显著降低单增李斯特菌定殖靶器官(肝脏和脾脏)内的菌落数,缓解了靶器官的病理损伤,降低了小鼠的死亡率。为了进一步确定姜黄素抑制LLO活性的机制,我们使用计算生物学方法模拟出姜黄素与LLO的潜在结合位点为V100和L503。不同于我们筛选到的5种黄酮类化合物,姜黄素通过结合在LLO的D3和D4结构域之间,影响了LLO寡聚体的形成。为了验证计算生物学模拟的结果,我们将上述两个位点突变后,进行了溶血实验,结果显示,姜黄素抑制LLO突变蛋白V100A及L503A溶血作用的能力显著下降。与此结果相似,LDH释放结果显示,姜黄素对突变蛋白所引起的细胞的保护效果也显著下降。结果提示,V100和L503确实是姜黄素与LLO结合的重要位点。膜结合实验与LLO寡聚化实验结果显示,姜黄素不影响LLO与细胞膜的结合,但可以减少LLO寡聚体形成。以上实验结果表明,姜黄素可以通过降低LLO寡聚体的形成抑制LLO的溶血活性。研究结果表明,姜黄素是一种潜在的治疗单增李斯特菌感染的药物或者抗生素疗法的辅助药物。
【关键词】：单增李斯特菌 单增李斯特菌溶血素 姜黄素 抗感染
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要4-6
• abstract6-12
• 前言12-14
• 第一篇 文献综述14-23
• 第一章 单增李斯特菌研究进展概述14-16
• 1.1 微生物学14
• 1.2 流行病学14-15
• 1.3 发病机制15
• 1.4 临床表现15-16
• 第二章 单增李斯特菌毒力因子概述16-21
• 2.1 内化素17
• 2.2 溶血素17-19
• 2.3 Actin A19-21
• 第三章 姜黄素研究进展21-23
• 3.1 抗氧化活性21
• 3.2 抗炎活性21-22
• 3.3 抗癌活性22-23
• 第二篇 研究内容23-57
• 第1章 天然抗单增李斯特菌溶血素药物的筛选23-29
• 1.1 材料和方法23-25
• 1.2 结果25-27
• 1.3 讨论27-28
• 1.4 小结28-29
• 第2章 姜黄素抑制单增李斯特菌从吞噬泡内逃逸29-42
• 2.1 材料和方法29-34
• 2.2 结果34-39
• 2.3 讨论39-40
• 2.4 小结40-42
• 第3章 姜黄素对单增李斯特菌感染小鼠的保护作用42-48
• 3.1 材料和方法42-44
• 3.2 结果44-46
• 3.3 讨论46
• 3.4 小结46-48
• 第4章 姜黄素抑制单增李斯特菌溶血素的分子机制研究48-57
• 4.1 材料方法48-51
• 4.2 结果51-55
• 4.3 讨论55-56
• 4.4 小结56-57
• 结论57-58
• 参考文献58-66
• 导师简介66-68
• 作者简介68-69
• 硕士期间发表的学术论文69-70
• 致谢70

【参考文献】

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1 王建锋;抗单核细胞增多性李斯特菌溶血素化合物的发现及作用机制研究[D];吉林大学;2015年

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本文编号：505137