三种小儿常见病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

发布时间：2017-10-18 14:10

  本文关键词：三种小儿常见病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

  更多相关文章： 呼吸道合胞病毒 腺病毒 轮状病毒 荧光定量PCR 复合探针

【摘要】：小儿呼吸道感染、肠道感染是小儿感染性疾病中最为常见的两种疾病。这两类疾病中80%以上为病毒感染。在病毒感染性疾病中,呼吸道合胞病毒和C组腺病毒是婴幼儿时期呼吸道病毒感染最常见的病原体,可引起严重的毛细支气管炎和肺炎；而F组腺病毒和轮状病毒作为引起婴幼儿腹泻的最常见病原在世界各地均有散发和流行,因此对主要病原体进行监测和检测,在防控小儿传染病中具有重要的意义。 自从1996年美国Applied Biosystems公司率先推出实时荧光定量PCR技术以来,该技术迅速被广泛应用于基础研究和病原体检测。实时荧光定量PCR技术可以对初始模板定量,具有特异性强、重复性好、灵敏度高、操作简便快捷、可实时监测等其他技术无法替代的优点已成为了核酸检测的重要工具：而复合探针技术是在荧光定量PCR基础上开发的新技术,除具备实时荧光定量PCR技术的全部优点外,还具有高效,快速,背景干扰小且成本低等优点,为病原微生物检测提供一种更为可靠有效的检测方法。本文以实时荧光定量PCR技术为基础,旨在对呼吸道合胞病毒、腺病毒及轮状病毒分别建立一种高效灵敏的实时荧光定量PCR检测方法,实现快速准确诊断,为进一步扩大小儿传染性疾病的监测和流行病学研究提供可靠有效的方法。 依据TaqMan探针、复合探针实时荧光定量PCR引物探针设计原则,分别设计特异性的引物和探针,通过对比实验筛选出最佳引物探针组合：对PCR扩增体系中热启动Taq酶用量、逆转录酶用量、逆转录酶反应时间、PCR退火温度等反应体系和反应条件进行优化,建立最佳的实时荧光定量PCR检测方法；并对‘所建立的荧光定量PCR方法的灵敏性、特异性及精密性进行评价；同时将所建立的方法用于临床发热、肺炎和腹泻婴幼儿患者的痰液、粪便标本检测,对本方法的检测效果进行评估。 经优化,确立了呼吸道合胞病毒、腺病毒、轮状病毒最佳反应体系和反应条件；呼吸道合胞病毒的检测灵敏度RSV A型最低可达2.0×102copies/mL、RSV B型最低可达5.0×102copies/mL;与非呼吸道合胞病毒等常见呼吸道病毒均无交义反应；批间批内变异系数均小于5%：对呼吸首合胞病毒感染患者咽拭子标本的检测结果表明：该方法与临床诊断结果的符合牢为99.23%。腺病毒的检测灵敏度ADV2型最低可达2.0×101PFU/ml、ADV40型最低可达5.0×101PFU/ml;与非腺病毒等常见呼吸道病毒、肠道炳毒均无交义反应；批间批内变异系数均小于5%；对腺病毒感染患者咽拭子、粪便标本的检测结果表明：该方法与临床诊断结果的符合率分别为99.14%、99.09%。轮状病毒的检测灵敏度RV SA-11标准株最低可达5.0×101PFU/ml;与非轮状病毒等常见肠道病毒均无交文反应：批间批内变异系数均小于5%；对来自王家医院轮状病毒感染患者粪便标本的检测结果表明：该方法与临床诊断结果的符合率分别为98.63%、99.17%和99.14%。 本研究所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速准确、特异、高灵敏度的对三种小儿常见病毒核酸进行定性检测,为临床提供新的更为可靠的检测方法。
【关键词】：呼吸道合胞病毒 腺病毒 轮状病毒 荧光定量PCR 复合探针
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R725.1;R440
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 第一章 前言13-30
• 1.1 呼吸道合胞病毒13-16
• 1.1.1 生物学性状13-14
• 1.1.2 流行病学14-15
• 1.1.3 临床表现15-16
• 1.1.4 临床诊断16
• 1.2 腺病毒16-21
• 1.2.1 生物学性状16-18
• 1.2.2 流行病学18-19
• 1.2.3 临床表现19-20
• 1.2.4 临床诊断20-21
• 1.3 轮状病毒21-24
• 1.3.1 生物学性状21-22
• 1.3.2 流行病学22
• 1.3.3 临床表现22-23
• 1.3.4 临床诊断23-24
• 1.4 实时荧光定量PCR24-28
• 1.4.1 实时荧光定量PCR24-25
• 1.4.2 TaqMan探针荧光定量PCR25-26
• 1.4.3 复合探针荧光定量PCR26-28
• 1.5 本试验的立题依据和基本思路28-30
• 1.5.1 立题依据28
• 1.5.2 基本思路28-30
• 第二章 呼吸道合胞病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用30-45
• 2.1 引言30
• 2.2 实验材料、试剂与实验仪器30-31
• 2.3 实验方法与步骤31-33
• 2.3.1 引物探针31
• 2.3.2 RSV病毒RNA的提取31-32
• 2.3.3 TaqMan探针与复合探针检测结果比较32
• 2.3.4 实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立32
• 2.3.5 线性关系检测32
• 2.3.6 灵敏度实验32-33
• 2.3.7 特异性实验33
• 2.3.8 精密性实验33
• 2.3.9 临床标本检测33
• 2.4 结果33-44
• 2.4.1 引物与探针33-36
• 2.4.2 TaqMan探针与复合探针检测结果比较36-37
• 2.4.3 实时荧光定量RT-PCR检测37-38
• 2.4.4 线性关系分析38
• 2.4.5 灵敏度分析38-40
• 2.4.6 特异性分析40-41
• 2.4.7 精密性分析41-43
• 2.4.8 临床标本的检测分析43-44
• 2.5 讨论44-45
• 第三章 腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用45-61
• 3.1 引言45
• 3.2 实验材料、试剂与实验仪器45-46
• 3.3 实验方法与步骤46-49
• 3.3.1 引物探针46-47
• 3.3.2 ADV病毒DNA的提取47
• 3.3.3 TaqMan探针与复合探针检测结果比较47
• 3.3.4 实时荧光定量PCR检测方法的建立47-48
• 3.3.5 线性关系检测48
• 3.3.6 灵敏度实验48
• 3.3.7 特异性实验48-49
• 3.3.8 精密性实验49
• 3.3.9 临床标本检测49
• 3.4 结果49-60
• 3.4.1 引物与探针49-52
• 3.4.2 TaqMan探针与复合探针检测结果比较52-53
• 3.4.3 实时荧光定量PCR检测53-54
• 3.4.4 线性关系分析54
• 3.4.5 灵敏度分析54-56
• 3.4.6 特异性分析56-57
• 3.4.7 精密性分析57-59
• 3.4.8 临床标本的检测分析59-60
• 3.5 讨论60-61
• 第四章 轮状病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用61-78
• 4.1 引言61
• 4.2 实验材料、试剂与实验仪器61-62
• 4.3 实验方法与步骤62-65
• 4.3.1 引物探针62-63
• 4.3.2 RV病毒RNA的提取63
• 4.3.3 TaqMan探针与复合探针检测结果比较63
• 4.3.4 实时荧光定量RT-PCR检测63-64
• 4.3.5 线性关系检测64
• 4.3.6 灵敏度实验64
• 4.3.7 特异性实验64
• 4.3.8 精密性实验64-65
• 4.3.9 临床标本检测65
• 4.4 结果65-77
• 4.4.1 引物与探针65-70
• 4.4.2 TaqMan探针与复合探针检测结果比较70-71
• 4.4.3 实时荧光定量PCR检测71
• 4.4.4 线性关系分析71-72
• 4.4.5 灵敏度分析72-73
• 4.4.6 特异性分析73
• 4.4.7 精密性分析73-75
• 4.4.8 临床标本的检测分析75-77
• 4.5 讨论77-78
• 第五章 总结与展望78-79
• 附录1 本文所使用的仪器79-80
• 附录2：TIANamp Virus RNA Kit病毒RNA提取试剂盒说明书80-81
• 附录3：PCR扩增产物测序图81-82
• 附录4：RSV引物探针同源性分析82-86
• 附录5：ADV引物探针同源性分析86-92
• 附录6：RV-1引物探针同源性分析92-99
• 附录7：RV-2引物探针同源性分析99-106
• 参考文献106-116
• 致谢116-117
• 学位论文评阅及答辩情况表117

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 张其威,游上游,孙继民,吴旗,余春华,张楚瑜;呼吸道合胞病毒实时荧光定量PCR检测[J];第一军医大学学报;2005年07期

2 王梅;小儿急性呼吸道感染的病原学研究[J];中国儿童保健杂志;2003年02期

3 刘崇海;杨锡强;魏钰书;;呼吸道合胞病毒病原学检测技术的研究进展[J];国际儿科学杂志;2006年01期

4 袁亚男;刘文忠;;实时荧光定量PCR技术的类型、特点与应用[J];中国畜牧兽医;2008年03期

5 陈苏红,王小红,张敏丽,王升启;复合探针荧光定量PCR方法的建立[J];生物技术通讯;2003年02期

，

本文编号：1055345