血液提取总RNA方法的优化及其在支气管肺发育不良患儿血液内TLK1表达的应用

发布时间：2017-10-19 19:13

  本文关键词：血液提取总RNA方法的优化及其在支气管肺发育不良患儿血液内TLK1表达的应用

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【摘要】：研究背景 在临床上，已有多种针对疾病的辅助检查,其中通过血液的检查占多数，血液检查具有操作简便、标本易取及对被检查者创伤相对较小的优点，但也存在一些缺点，如操作频繁易引起感染、取血量过多可导致贫血等。对于早产儿而言，各脏器功能发育不成熟，生理功能发育不完善，骨髓造血功能薄弱，过早地停止了胎内的骨髓外造血因而不能适应生后机体快速生长发育，体内铁储存少等，导致早产儿贫血非常常见；并且由于早产儿针对感染、黄疸、电解质紊乱等疾病，血液检查多，抽血频繁，大量的采血可进一步导致贫血。严重的贫血可导致呼吸暂停、生长障碍、营养缺乏，易并发感染等。通过血液样本做的检查方法包括生化、培养及致病基因的检测等，而基因检测则需要通过提取血液中的RNA得出检验结果。血液RNA的提取方法多种多样，包括试剂盒法、传统TRIZOL法及SDS法等。这些方法各有利弊，临床上通过何种方法提取血液RNA效果最好，目前尚无明确定论，值得我们开展研究，用于筛选临床血液提取RNA的最佳方法。 支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasias，BPD），以往又称为新生儿慢性肺病（chronic lung disease，CLD），是早产儿、特别是小早产儿呼吸系统常见疾病，是婴儿期慢性呼吸系统疾病的主要原因。近年来，随着早产儿救治技术的不断增高，BPD的发生率也随之增加，严重影响着早产儿的存活率及生长发育状态。目前支气管肺发育不良已越来越被重视，现已成为新生儿学科热门的学术研究。丝氨酸/苏氨酸蛋白扰动样激酶1（Tousled-like Kinase1，TLK1），又称PKU-beta，是蛋白激酶家族和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的核心蛋白，首先被发现于花和叶子的组织中，之后也被广泛发现于人体的各个组织内。在细胞周期S期的调节激酶中，TLK1作用最大。TLK1具有参与染色体分离、调节基因转录、蛋白氨基酸磷酸化及应答DNA损伤修复的功能，TLK1也参与多种信号通路，在机体的各种反应中起着重大的作用。据研究，在乳腺癌、前列腺癌、胆管癌及肺鳞状细胞癌细胞中发现TLK1存在高度表达。研究目的 1.本课题旨在研究改进提取血液RNA的方法，通过本研究在确保RNA的完整性的情况下，达到降低临床患儿的取血量的目的，更有利于保护患儿、保证临床实验的完成。 2.鉴于TLK1具有应答损伤修复功能，而支气管肺发育不良患儿长期受机械通气及吸氧的损伤及修复，肺组织及血液内TLK1的表达可能不同于其他无长时间损伤修复的患儿。本课题拟采用实时定量荧光PCR（Real-Time PCR）技术定量检测支气管肺发育不良患儿血液标本内TLK1的含量，旨在初步探讨支气管肺发育不良患儿体内TLK1表达的情况。研究方法 1.以TRIZOL法为基本研究方法，通过分别提取等量全血、血浆及血清的总RNA，选择总RNA提取量最多的一种血液标本；随后，对不同血液量所提取的总RNA进行比较，得出最佳的实验取血量。 2.将上述抽取血液RNA的实验方法应用于临床标本检测，并对此方法进行验证：以来源于本院极早产新生儿重症监护病房（极早产NICU）内诊断为BPD的18名患儿抽取的静脉血为研究对象，根据病例组病例患儿的基本信息，以10名近胎龄、近似日龄的非BPD患儿抽取的静脉血为对照，分别采用TRIZOL法提取RNA，并采用反转录PCR（ReversedTranscript PCR）方法对所抽提的RNA反转录成cDNA。运用Real-Time PCR方法对BPD患儿血液TLK1产物做定量分析，采用△△Ct法，以GVPDH为内参，以非BPD患儿组为对照。结果 1.计算并通过比较TRIZOL法，在等量（0.1ml）全血、血浆及血清提取的总RNA的得率和质量分别为：全血提取RNA得率为（232.2904±58.42103）、纯度为（1.7421±0.6920），血浆提取RNA得率为（142.0728±45.24386）、纯度为（1.4765±0.5418），血清提取RNA的率为（198.7496±51.47629）、纯度为（1.5833±0.6257），因此，全血提取的总RNA的得率明显优于血清及血浆，总RNA的纯度也最高； 2.以不同的全血量通过不同剂量的TRIZOL提取总RNA比较，在0.1-1ml的全血量的范围内，以适量的TRIZOL提取的总RNA的量，全血量越多，提取的RNA的得率及纯度越高，但是，全血量越多，提取完整总RNA所需TRIZOL量越多，将不利于后期实验操作，因此选取最佳的全血量进行提取血液RNA的实验对患者及后期实验研究非常重要。实验结果表明以0.3ml的全血量及1mlTRIZOL即可得到完整的总RNA量，且纯度也能达到1.8-2.0这一标准值，临床取血量相对较少，是最佳的实验取血量； 3.以上述实验全血量（0.3ml）及实验方法对支气管肺发育不良组及对照组共28个样本提取RNA，除1个样本外，，其余27个样本提取的总RNA的得率及纯度均在标准范围内，证明此提取血液RNA的实验方法有效； 4.对所有样本中TLK1的含量进行Real-Time PCR定量分析，再运用t检验、△△Ct法等统计学方法做出分析，结果表明，支气管肺发育不良组TLK1的表达高于非支气管肺发育不良组。结论 1.等量的全血获得的总RNA的得率及纯度最高，0.3ml全血及1mlTRIZOL即可满足实 验需要； 2.BPD患儿静脉全血内TLK1的表达高于非BPD组。相对于非支气管发育不良患儿， 支气管肺发育不良患儿体内TLK1表达增高。
【关键词】：TRIZOL法 全血RNA 支气管肺发育不良 TLK1 Real-Time PCR
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R722.6
【目录】：

• 英文缩略词表4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-14
• 参考文献12-14
• 第一部分 血液提取总 RNA 方法的优化14-20
• 材料与方法14-16
• 结果16-18
• 讨论18
• 参考文献18-20
• 第二部分 血液提取总 RNA 方法改进后的临床应用20-33
• 材料与方法20-27
• 结果27-30
• 讨论30-32
• 参考文献32-33
• 综述33-38
• 参考文献35-38
• 作者简介38-39
• 致谢39

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：1062833