人羊膜细胞生物学特性及人羊膜上皮细胞对高氧所致肺损伤作用的实验研究

发布时间：2017-10-20 12:37

  本文关键词：人羊膜细胞生物学特性及人羊膜上皮细胞对高氧所致肺损伤作用的实验研究

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【摘要】：目的：分离培养人羊膜上皮细胞(human amnion epithelial cells,hAECs)和人羊膜间充质干细胞(human amnion mesenchymal stem cells,hAMSCs)并鉴定其生物学特性，探讨hAECs在高氧所致新生大鼠肺损伤中的作用。 实验方法： 1.细胞分离及鉴定：收集符合选入标准的足月剖宫产胎盘上的羊膜组织，采用低速多次胰蛋白酶-胶原酶消化法，分别分离获取hAECs及hAMSCs。观察两种细胞形态，通过绘制生长曲线了解增殖情况；采用间接免疫荧光染色检测角蛋白19（cytokeratin19,CK19）及波形蛋白；流式细胞仪分析术检测细胞表面抗原CD29、CD73、CD44、CD166、CD90、CD105、CD49e等；逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测多能干细胞标志八聚体结合转录因子(octamer-binding transcription factor4,Oct-4)、Nanog；油红O染色及茜素红染色法分别检测成脂及成骨诱导分化潜能，对两种细胞生物学特性进行鉴定。 2. hAECs对高氧所致肺损伤的作用：8窝（8-12只/窝）出生24h内无特定病原体(SPF)级新生SD大鼠，随机分为正常组、高氧组、高氧+PBS组、高氧+hAECs组。正常组新生大鼠在空气中常规饲养12天；高氧组、高氧+PBS组、高氧+hAECs组新生大鼠生后24h内放入氧浓度90%的环境中持续高氧，常规饲养。高氧第8天，高氧+hAECs组新生大鼠从气管内注入CM-Dil荧光标记的第3代hAECs5×105个，体积40μL；高氧+PBS组新生大鼠从气管内注入PBS液，体积40μL；正常组、高氧组不予任何处理。第10天停止高氧，高氧组、高氧+PBS组、高氧+hAECs组新生大鼠放入空气中继续常规饲养2天。第12天，分别采集各组新生大鼠血液及肺组织标本进行检测。用荧光显微镜追踪被标记的hAECs；肺组织切片HE染色，观察对比各组肺组织病理形态学差异，进行肺损伤评分；检测各组血清及肺组织中炎性因子白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、白细胞介素10（interleukin-10,IL-10）含量，氧化应激反应指标超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量及肺组织中髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）活性。 结果: 1.hAECs和hAMSCs生物学特性 1.1hAECs为圆形或椭圆形，呈铺路石样生长，，最多传至第5代，hAMSCs为成纤维细胞样的长梭形，呈放射状或漩涡状分布生长，可传至30代左右。 1.2hAECs表达上皮细胞标志CK19，间有波形蛋白表达，hAMSCs表达波形蛋白，不表达CK19；两种细胞均表达CD29、CD73、CD44、CD166、CD90及OCT-4、Nanog等标志， hAECs不表达CD49e、CD105。 1.3细胞成脂油红O染色可见红色脂滴，成骨茜素红染色可见红色钙化结节。 2. hAECs对高氧所致肺损伤的作用 2.1高氧+hAECs组新生大鼠肺组织中有少量细胞定植，肺泡间隔厚度减低，辐射状肺泡数增多，使肺部急性病理改变得到部分改善。 2.2高氧+hAECs组新生大鼠中促炎因子IL-6水平较高氧组明显下降，与高氧+PBS组差异无意义；肺组织中IL-10水平各组差异较大；血清中IL-10水平高氧组明显高于正常组，余各组之间无差异。 2.3高氧+hAECs组肺组织中SOD、MPO活性增高及MDA浓度降低均较高氧+PBS组明显，两组差异有意义；血清中高氧+hAECs组与高氧组相比SOD活性增高及MDA浓度降低明显，与高氧+PBS组差异无意义。结论：1. hAECs和hAMSCs均具有干细胞特性；2. hAECs可部分改善高氧引起的新生大鼠肺损伤；3.新生大鼠肺损伤中氧化应激反应可能起主导作用，hAECs调节氧化应激反应作用明显，减轻氧化应激反应可能成为防治高氧肺损伤进而减少BPD发生的有效途径。
【关键词】：人羊膜上皮细胞 人羊膜间充质干细胞 高氧 肺损伤 支气管肺发育不良
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R722.6
【目录】：

• 缩略词表4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 第一部分 人羊膜细胞生物学特性的实验研究12-26
• 材料和方法12-18
• 结果18-23
• 讨论23-26
• 第二部分 人羊膜上皮细胞对高氧所致肺损伤作用的实验研究26-43
• 材料与方法26-32
• 结果32-38
• 讨论38-43
• 全文总结43-44
• 参考文献44-50
• 附图50-55
• 综述55-63
• 参考文献60-63
• 攻读学位期间取得的研究成果63-64
• 致谢64-65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：1067239