靶向沉默TGF-β1表达的shRNA的筛选及其对肾小管上皮细胞EMT的抑制作用

发布时间：2017-10-23 13:07

  本文关键词：靶向沉默TGF-β1表达的shRNA的筛选及其对肾小管上皮细胞EMT的抑制作用

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【摘要】：背景肾小管上皮细胞-间充质转分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)在肾脏间质纤维化形成过程中起到重要作用。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是肾小管上皮细胞EMT过程中的重要调控因子。RNA干扰技术可以诱导特异性靶基因mRNA降解,从而抑制靶基因的表达。因此,筛选靶向沉默TGF-β1表达的短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)对防治肾小管-肾间质纤维化具有重要意义。 目的筛选靶向沉默TGF-β1表达的shRNA,并探讨其对肾小管EMT的抑制作用。以期为进一步研究参与TGF-β1诱导肾小管-肾间质纤维化的下游分子奠定基础,为利用RNA干扰技术沉默TGF-β1的表达以防治肾小管-肾间质纤维化的可行性提供科学依据。 方法 1.覆盖TGF-β1基因cDNA全长,设计靶向TGF-β1mRNA的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),通过对所设计的所有siRNA进行同源性分析筛选出5条siRNA。以筛选的5条siRNA为基础,设计靶向TGF-β1mRNA的shRNA5条。所有shRNA的DNA序列均送公司合成并退火。 2.采用分子克隆方法构建含TGF-β1shRNA的p-Genesil-shRNA真核表达重组质粒(p-Genesil-shRNA1、p-Genesil-shRNA2、p-Genesil-shRNA3、p-Genesil-shRNA4和p-Genesil-shRNA5)及p-Genesil-1-shRNA-vect对照质粒(含无关shRNA),并通过酶切和测序方法进行鉴定。 3.以肾小管上皮细胞HKC为研究对象,通过脂质体介导将p-Genesil-1-shRNA-vect质粒和各重组表达质粒转染入血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)或高糖环境激活的HKC细胞(分别命名为：p-Genesil-1-vect细胞、p-Genesil-shRNA1细胞、p-Genesil-shRNA2细胞、p-Genesil-shRNA3细胞、p-Genesil-shRNA4细胞和p-Genesil-shRNfA5细胞),通过Western blotting方法检测TGF-β1表达的变化,筛选可靶向沉默TGF-β1表达的shRNA。以高糖或Ang Ⅱ刺激的p-Genesil-1-vect细胞为对照组,以高糖或Ang Ⅱ刺激的p-Genesil-shRNA4细胞为实验组,通过Western blotting方法检测a-SMA、角蛋白、Ⅰ型胶原和波形蛋白表达的变化,观察沉默TGF-β1表达对肾小管上皮细胞EMT的抑制作用。 结果 1.真核表达重组质粒的构建及鉴定 酶切结果显示,5种重组质粒均可切出与预计相符的目的片段。测序结果显示,所有shRNA编码序列与设计一致,无突变、插入和丢失,方向正确。2.靶向沉默TGF-β1表达的shRNA的筛选 Western blotting结果显示：与HKC细胞相比,高糖或Ang Ⅱ刺激的HKC细胞和p-Genesil-1-vect细胞中TGF-β1表达均显著增高(P0.05或0.01),而后二者之间TGF-β1表达差异无显著性(P0.05)。与高糖或Ang Ⅱ刺激的p-Genesil-1-vect细胞相比,高糖或Ang Ⅱ刺激的各组p-Genesil-shRNA细胞中TGF-β1表达均显著降低(P0.05或0.01)。以p-Genesil-shRNA4细胞降低最明显。 3.沉默TGF-β1表达对肾小管EMT的抑制作用 Western blotting结果显示,与高糖或Ang Ⅱ刺激的p-Genesil-1-vect细胞相比,高糖或Ang Ⅱ刺激的p-Genesil-shRNA4细胞中α-SMA、波形蛋白、Ⅰ型胶原的表达均显著降低(P0.01),而角蛋白表达显著升高(P0.01)。 结论 1.筛选出1条尚未见报道的可靶向沉默TGF-β1表达的shRNA。 2.沉默TGF-β1的表达可抑制人肾小管上皮细胞HKC转分化。
【关键词】：肾小管-肾间质纤维化 转化生长因子β1 上皮细胞-间充质转分化 RNA干扰 短发夹RNA
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R726.9
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 第一部分 靶向沉默TGF-β1表达的shRNA的设计及真核表达重组质粒的构建和鉴定材料与方法12-20
• 1 材料与方法12-18
• 2 结果18-20
• 第二部分 靶向沉默TGF-β1表达的shRNA的筛选及其对肾小管EMT的抑制作用材料与方法20-36
• 1 材料与方法20-27
• 2 结果27-36
• 讨论36-41
• 小结41-42
• 参考文献42-45
• 综述：转化生长因子-β1在慢性肾脏疾病进展中的研究45-66
• 参考文献54-66
• 附录 英文缩略词66-67
• 攻读学位期间发表文章情况67-68
• 致谢68-69
• 个人简历69

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本文编号：1083531