脂多糖对神经胶质细胞NgR表达影响的实验研究

发布时间：2017-10-25 20:04

  本文关键词：脂多糖对神经胶质细胞NgR表达影响的实验研究

  更多相关文章： 少突胶质细胞前体 小胶质细胞 Nogo受体 Toll样受体4 肿瘤坏死因子α

【摘要】：目的：分离和培养早产大鼠脑组织MG和OPCs；构建NgR特异性shRNA慢病毒载体；观察脂多糖诱导新生鼠小胶质细胞和少突胶质细胞前体NgR的表达及变化，了解NgR的表达在TLR-4介导的神经胶质细胞释放炎性细胞因子中的作用。 方法：采用振荡和差速贴壁法体外纯化培养MG和OPCs，分别用特异性抗体CD11b和O4进行细胞免疫组织化学鉴定；构建NgR特异性shRNA的重组慢病毒载体，慢病毒载体导入NgR特异性siRNA沉默NgR基因；本实验分为7组，第一组（OPCs单独培养对照组)：在培养液中加入与对照组LPS相同体积的DMEM/F12；第二组（OPCs单独培养诱导组）：在培养液中加入100μg/L LPS；第三组（OPCs和MG共同培养对照组）：在培养液中加入与对照组LPS相同体积的DMEM/F12；第四组（OPCs和MG共同培养诱导组）在培养液中加入100μg/L LPS；第五组（OPCs和MG共同培养加TLR-4抑制剂诱导组）：在培养液加入100μg/L的TAK-242，24h后再加入脂多糖100μg/L；第六组（NgRShRNA转染OPCs共同培养诱导组）：在培养液中加入100μg/L LPS；第七组（NgRShRNA转染MG单独培养诱导组）：在培养液中加入100μg/L LPS。各组培养48h。用实时荧光定量PCR检测MG、OPCs的NgR和MG的TLR-4基因的表达情况，并用ELISA测各组TNF-α的含量。 结果：1、用振荡和差速贴壁法培养出大量、高纯度的小胶质细胞和少突胶质细胞前体，并分别用特异性抗体CD11b和O4成功鉴定培养出细胞。2、成功构建出了NgR特异性shRNA的重组慢病毒载体，并从分子水平抑制了NgR基因的表达。3、第三、四、五、七组MG的TLR-4基因表达量的2-ΔΔct值分别为0.4005±0.2384、1.2010±0.3553、0.1023±0.4543、0.4896±0.2006。LPS诱导组较其他对照组及处理组的小胶质细胞的TLR-4的表达水平均显著增高，差异具有统计学意义（P0.05）；4、第一、二、三、四、五、六、七组TNF-α量（pg/ml）分别为9.6408±0.6607、10.6483±0.3490、21.7436±1.6115、130.0370±1.5246、83.6709±1.9950、107.0324±2.8725、100.5844±2.9576。OPCs经LPS诱导后不能释放TNF-α，MG经LPS诱导后较其对照组及处理组的TNF-α的含量显著增高，差异具有统计学意义（P0.05）。5、第三、四、五、七组MG的NgR基因表达量的2-ΔΔct值分别为0.1048±0.0305、1.0758±0.1859、0.4195±0.1121、0.1145±0.0441。第一、二、三、四、五、六组OPCs的NgR基因表达量的2-ΔΔct值分别为1.0243±0.2729、3.2343±0.4183、0.4053±0.1253、10.9138±0.3910、3.8903±0.4886、0.7659±0.2766。LPS诱导组较其他对照组及处理组的MG和OPCs的NgR的表达水平均显著增高，，差异具有统计学意义（P0.05）。 结论：1.振荡和差速贴壁可以培养出小胶质细胞和少突胶质细胞前体。2、通过体外细胞实验证实了化学合成的NgR shRNA慢病毒载体能够特异性抑制神经细胞中NgR的表达，为动物实验奠定了正确基础。3、细菌感染、炎症使小胶质细胞和少突胶质细胞前体的NgR表达增高。4、脂多糖诱导小胶质细胞表达大量TLR-4的需要NgR的介导，TLR-4可能存在上调NgR基因的表达的作用。
【关键词】：少突胶质细胞前体 小胶质细胞 Nogo受体 Toll样受体4 肿瘤坏死因子α
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R722.1
【目录】：

• 中英文缩略词对照表5-8
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 前言13-17
• 研究材料（资料、内容）与方法17-30
• 1. 研究内容17
• 1.1 早产 SD 大鼠 OPCs 和 MG 的分离培养和鉴定17
• 1.2 NgR 特异性 shRNA 慢病毒载体的构建17
• 1.3 观察 NgR 及 TLR-4 基因的表达17
• 2. 材料与方法17-29
• 2.1 实验材料17-20
• 2.2 实验方法20-29
• 3. 统计学处理29
• 4. 实验流程29-30
• 结果30-38
• 1. 细胞培养结果30-31
• 2. NgR 干扰的沉默效率31
• 3. 分组实验结果31-38
• 讨论38-44
• 结论44-45
• 参考文献45-50
• 综述50-64
• 参考文献59-64
• 作者简介及读研期间主要科研成果64-65
• 致谢65

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本文编号：1095266