金欣口服液对RSV活化诱导的TLR7、IRF7、IFN-α调控作用

发布时间：2017-10-28 04:32

  本文关键词：金欣口服液对RSV活化诱导的TLR7、IRF7、IFN-α调控作用

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【摘要】：小儿病毒性肺炎是儿科临床最常见的感染性疾病之一,严重危害着小儿的健康。我国卫生部将小儿肺炎列为重点防治的四种儿科疾病之一。病毒性肺炎大约占到小儿肺炎的—半左右,而呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是小儿病毒性肺炎的重要病原体之一。在婴幼儿的病毒性肺炎中,RSV肺炎较为常见。 目前,现代西医学尚无特效的抗RSV病毒药,也无安全有效的RSV疫苗。中药在抗病毒感染性疾病治疗中有独特优势,临床研究及实验研究证明金欣口服液是抗RSV感染的有效中药。TLRs作为I型跨膜受体,可识别不同微生物的病原分子相关模式。而RSV为单链RNA病毒,其进入机体内后,内部所含的单链RNA(ssRNA)外露,可以识别病毒ssRNA的TLR7就可能发挥重要作用。本研究从TLR7信号转导通路入手,通过研究临床治疗RSV肺炎的有效方金欣口服液对RSV活化诱导的TLR7、IRF7、IFN-α的调控作用,研究金欣口服液抗RSV感染的机制。 目的 通过研究金欣口服液对RSV活化诱导的TLR7、IRF7、IFN-α的调控作用,研究金欣口服液抗RSV感染的机制。 方法 本实验采用Realtime RT-PCR、Western blot、ELSIA法检测RSV感染后RAW264.7细胞和BALB/c小鼠的TLR7、IRF7、IFN-α的表达水平。Realtime RT-PCR数据采用相对定量法计算,其余数据采用SPSS18.0软件进行统计学处理。 结果 1.体外实验 (1)RSV感染RAW264.7细胞24h后,TLR7mRNA表达水平与正常细胞组相比,显著升高(P0.05)；利巴韦林组和金欣含药血清组TLR7mRNA表达水平均为正常细胞组的0.5倍以下,有显著性差异(P0.05),与RSV感染组相比TLR7mRNA表达量降低(P0.05),其中金欣含药血清的下调作用较利巴韦林更为明显。IRF7mRNA表达量为正常细胞组的3.12倍,明显增高并具有显著性差异(P0.05),利巴韦林和金欣含药血清均可以显著下调RSV感染的RAW264.7细胞的IRF7mRNA表达(P0.05),金欣含药血清的下调作用与利巴韦林相比,未见明显差异。 (2)RSV感染RAW264.7细胞24h后TLR7蛋白表达较正常组增加,而金欣含药血清可显著下调TLR7蛋白表达(P0.01)；IRF7表达量较正常组相比升高(P0.05),而金欣含药血清组的IRF7表达量较RSV组稍高,但无明显统计学意义(P0.05)。 (3)RSV感染RAW264.7细胞24h后取细胞上清,测得IFN-a的含量极低。 2.体内试验 (1)在RSV感染BALB/c小鼠24h后,TLR7mRNA表达量较正常组有升高趋势(P0.05),而金欣高、低剂量预防给药及利巴韦林有降低TLR7mRNA表达的趋势(P0.05),其中以金欣低预防组最为明显：RSV感染BALB/c小鼠72h后,TLR7mRNA的表达较24h时有所下降,而金欣组和利巴韦林组均较24h时明显增多,其中尤其以金欣低剂量治疗组上调作用最为明显；在RSV感染BALB/c小鼠144h后,TLR7mRNA的表达较72h时进一步下降,利巴韦林组和金欣口服液组较144h TLR7mRNA的表达下降,但与RSV感染组相比,利巴韦林组和金欣高治疗组均可上调TLR7mRNA的表达(P0.05),尤以金欣高治疗组的上调作用最为明显。 (2)在RSV感染BALB/c小鼠24h后,IRF7mRNA表达水平较正常组显著增高(P0.01),而金欣口服液预防给药组及利巴韦林组IRF7mRNA的表达较RSV感染组明显降低(P0.05),其中以金欣口服液低预防给药组的下调作用最为明显；随着感染时间延长RSV感染组IRF7mRNA逐渐下降,而金欣组和利巴韦林组的IRF7mRNA的表达上升并超过RSV感染组,其中金欣高治疗组IRF7mRNA的表达高于利巴韦林组(P0.05)。 (3)RSV感染BALB/c小鼠后TLR7的表达量下降(P0.05),而金欣口服液组对TLR7下调作用较RSV感染组更为显著(P0.05)。在感染初期BALB/c小鼠IRF7的表达量下降,而金欣口服液干预后,对IRF7表达量的下调更为明显,在感染晚期,金欣口服液高剂量治疗组与RSV感染组相比,可以提高IRF7的蛋白表达量(P0.05)。 (4)本研究体内实验表明在RSV感染小鼠早期IFN-α表达量升高(P0.05),金欣口服液低预防组及高预防组能明显提高IFN-α表达量,随感染时间延长IFN-α表达量较前下降,金欣口服液高、低治疗组均能明显提高IFN-α的表达(P0.05),持续起到抗病毒效应。病毒感染性疾病后期IFN-α均较前进一步下降,金欣口服液组IFN-α表达量较RSV感染组低(P0.05)。 结论 1.金欣口服能够从核酸转录和蛋白质合成层面调控TLR7和IRF7的表达。 2.金欣口服液对RSV感染RAW264.7细胞TLR7和IRF7的mRNA有下调作用,对TLR7蛋白有下调作用,对IRF7蛋白表达调控作用不显著。 3.金欣口服液对RSV感染BALB/c小鼠的TLR7和IRF7的mRNA表达量以及IRF7的蛋白表达量,在感染早期能够下调其表达,在感染后期能够上调其表达;对TLR7的蛋白表达量有下调作用。 4.金欣口服液对RSV感染BALB/c小、鼠的IFN-α表达量的影响,在感染早期能够上调其表达,在感染后期能够下调其表达。 5.金欣口服液是抗RSV感染的有效药物,其作用机制可能与调节TLR7信号转导通路上的TLR7、IRF7、IFN-α的表达量有关。
【关键词】：金欣口服液 呼吸道合胞病毒 Toll样受体7 干扰素调节因子7 干扰素-α
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R272
【目录】：

• 目录6-8
• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-15
• 第一部分 文献研究15-30
• 1 中医对RSV肺炎的相关认识15-21
• 1.1 病名溯源15-16
• 1.2 历代医家论肺炎的病因病机16-18
• 1.3 现代中医名家对肺炎的认识18-19
• 1.4 近现代儿科名家对肺炎喘嗽的认识19-20
• 1.5 中医药治疗RSV肺炎研究进展20-21
• 2 西医学对RSV肺炎的认识21-25
• 2.1 病原学特点21
• 2.2 RSV感染的免疫学机制21-23
• 2.3 RSV引起的疾病23
• 2.4 RSV流行病学研究23-24
• 2.5 临床治疗24-25
• 3 RSV与TLRs的关系25-28
• 3.1 Toll样受体家族25-26
• 3.2 TLRs与RSV感染的关系26-27
• 3.3 TLR7、IRF7研究进展27-28
• 4 金欣口服液的前期研究成果28-30
• 第二部分 实验部分30-53
• 1 材料30-32
• 1.1 病毒30
• 1.2 细胞30
• 1.3 动物30
• 1.4 药物30
• 1.5 试剂30-31
• 1.6 仪器及设备31-32
• 2 方法32-39
• 2.1 金欣口服液及其含药血清的制备32
• 2.2 RSV的扩增及组织培养半数感染量(TCID_(50))的测定32-33
• 2.3 Hep-2细胞和RAW264.7细胞的培养33
• 2.4 RSV感染RAW262.7细胞模型的制备33
• 2.5 RSV感染BALB/c小鼠模型的制备33
• 2.6 实验分组、给药方案及标本的采集33-34
• 2.7 肺组织病理切片34
• 2.8 MTT法测定药物最大无毒浓度34
• 2.9 实时荧光定量PCR法检测金欣口服液对TLR7、IRF7的mRNA的转录水平34-36
• 2.10 免疫印迹法具体步骤36-38
• 2.11 ELISA法检测金欣口服液对RSV诱导IFN-α的表达水平38
• 2.12 数据统计38-39
• 3 结果39-53
• 3.1 RSV组织半数感染量(TCID_(50))39
• 3.2 金欣口服液含药血清、利巴韦林对RAW264.7细胞最大无毒浓度测定结果39
• 3.3 金欣口服液对RSV诱导TLR7mRNA、IRF7mRNA转录水平的调控作用39-43
• 3.4 金欣口服液对RSV诱导的TLR7、IRF7蛋白表达的影响43-48
• 3.5 金欣口服液对RSV诱导IFN-α表达水平的调控作用48-49
• 3.6 小鼠病理切片结果49-53
• 第三部分 讨论53-57
• 第四部分 结语57-59
• 1 结论57
• 2 创新之处57
• 3 研究展望57-59
• 参考文献59-64
• 英文缩略词表64-66
• 硕士在读期间发表论文66-67
• 致谢67-68
• 个人简历68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 赵霞;汪受传;胡钰;陈彩霞;徐建亚;;金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒感染细胞早期凋亡的影响[J];中华中医药杂志;2010年02期

2 赵霞;汪受传;张沛;周娣;徐建亚;;金欣口服液对呼吸道合胞病毒感染大鼠Ⅰ型干扰素表达的影响[J];中华中医药杂志;2011年07期

3 陆权;儿科常见病毒性呼吸道感染的病因治疗[J];世界临床药物;2003年07期

4 蔡旭玲;黄晓晖;王德全;周俊立;邹志辉;林晓晖;刘伟东;陈思东;;甘草的醇沉淀物体外抗RSV有效部位的筛选[J];广东药学院学报;2012年06期

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中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 李佳曦;金欣口服液及白藜芦醇对RSV活化诱导的TLR3及其信号通路的调控作用[D];南京中医药大学;2012年

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本文编号：1106712