TNF-α调控ORMDL3基因转录的机制研究

发布时间：2017-11-01 05:31

  本文关键词：TNF-α调控ORMDL3基因转录的机制研究

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【摘要】：目的： 血清类黏蛋白1样蛋白3(orosomucoid1-like protein3,ORMDL3)是迄今为止发现的与哮喘关联最有充分证据的基因,也是在儿童期起病哮喘的易感基因。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在哮喘发病尤其是在气道炎症、气道高反应性及气道重塑中起着重要作用。本实验的主要目的是探讨TNF-α对哮喘易感基因ORMDL3启动子活性的调控作用及其机制。 方法： 以人胚肾293(HEK-293)细胞基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增出Ets-1片段,并克隆进真核载体pcDNA内,构建含Ets-1基因的重组真核表达质粒pcDNA-Ets-1。利用过表达、突变质粒及RNA干扰方法测定Ets-1、p300、CREB对ORMDL3基因启动子活性的影响。ORMDL3萤光素酶报告质粒P1(pGL-84/+58)转染HEK-293细胞后,加或不加TNF-α再孵育24h,利用萤光素酶活性测定实验研究TNF-α对ORMDL3基因启动子活性的影响。突变或干扰Ets-1、p300、CREB,加或不加TNF-α孵育后研究TNF-α是否通过其中某一个或某几个位点对ORMDL3基因启动子水平发挥调控作用。TNF-α处理HEK-293细胞后,利用Real time PCR及Western blot检测TNF-α对Ets-1mRNA及蛋白水平的影响。 结果： 核酸序列分析及Western blot结果显示正确构建了含Ets-1基因的重组真核表达质粒。突变Ets-1、p300、CREB结合位点以及干扰Ets-1表达均能显著下调ORMDL3基因启动子活性；过表达Ets-1、CREB可上调ORMDL3基因启动子活性。TNF-α对ORMDL3基因启动子活性具有正向调控作用,且Ets-1结合位点突变或敲低Ets-1表达可明显降低TNF-α对ORMDL3基因启动子活性的上调作用。TNF-α能上调Ets-1的mRNA及蛋白水平,而对p300和CREB的表达没有显著影响。 结论： 在HEK-293细胞中,TNF-a通过Ets-1转录因子结合位点上调ORMDL3基因启动子活性。
【关键词】：ORMDL3 启动子 TNF-α Ets-1 支气管哮喘
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R725.6
【目录】：

• 目录4-5
• 英文~.写词简表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-14
• 材料与方法14-27
• 结果27-35
• 讨论35-38
• 结论38-39
• 参考文献39-44
• 综述44-55
• 参考文献49-55
• 攻读硕士学位期间公开发表的学术论文55-56
• 致谢56

【参考文献】

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1 黄玉;杨波;迟小华;刘丽宏;李薇;卢学春;;真核生物启动子的研究及应用[J];生物技术通讯;2010年02期

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本文编号：1125485