牛乳铁蛋白对大鼠小肠空肠上皮细胞株的影响研究

发布时间：2017-11-09 06:14

  本文关键词：牛乳铁蛋白对大鼠小肠空肠上皮细胞株的影响研究

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【摘要】：研究背景新生儿坏死性小肠结肠炎(neonatal necrotizing enterocolitis,NEC)是早产儿死亡的主要原因之一,是新生儿常见的消化道急症之一,主要发生在早产儿,且胎龄越小,出生体重越低,发生率越高。肠壁囊样积气和门静脉充气征为X线特征,发病因素具有多源性,故其发病机制至今尚不明确,大多认为与早产、喂养不当、感染、肠道黏膜缺氧缺血及细菌异常种植等原因有关,预防上也没有明确的指南。NEC患者轻者可能出现呕吐、腹胀,重者则可能出现嗜睡、体温不稳、休克或出现腹壁红肿、腹腔积液,短期内可引起多种严重的并发症(如肠狭窄、腹膜炎等),会出现小头畸形或严匝神经发育问题,且重症NEC有较高的致残率[3-4]。我国出生体质量1.5kg的婴儿NEC发病率6%～10%,国内病死率为10%～50%；美国出生体质量1.5 kg婴儿的发病率为5%～15%,病死率20%～30%。目前,临床上主要根据临床表现以及最常用的辅助检查方法腹部X线片作为早期诊断NEC的方法,但此后者虽对于诊断NEC特异度较高,但对于疾病的早期诊断却没有太大意义。临床中也可以通过B超发现门静脉的起泡帮助NEC的早期这段,而且临床中还有很多关于IL-8、IL-1以及IL-10受体拮抗剂或脂肪酸结合蛋白等生化指标用于辅助诊断NEC的研究,但仍缺乏较好的用于早期诊断NEC的血生化指标。新生儿坏死性小肠结肠炎其重要的病理生理过程复杂,理论上任何影响肠道血流的因素都会增加NEC的发生,加之新生儿或早产儿胃肠道功能的不完善,加之外界环境的改变感染,导致肠腔内细菌以及内毒素等由上皮细胞间隙进入人体造成局部组织或全身炎症反应。肠上皮细胞作为直接接触外界肠道微环境的细胞,对维持肠道功能具有不可替代的作用。肠道上皮细胞是维持肠道上皮通透性的执行者,起着至关重要的作用,一方面其可以作为机械屏障非选择性发挥抵御外来生物体及有毒物质进入人体的作用,另外一方面其可以特异性选择准许小分子物质、离子进入通过肠道上皮屏障,而将抗原大分子、外界的病原微生物等阻碍在屏障之外。许多研究都显示NEC的发病机制中肠道上皮细胞起着重要的作用。肠道作为人体重要的免疫器官,人体有80%的免疫细胞存在于肠道中,当NEC发生时,NEC会产生大量的炎症因子以及相关细胞因子,从而加重了肠道粘膜的损伤,同时也会造成其他重要器官,如脑的损伤。因此有许多研究都尝试通过口服抗生素来减少致病因素的发生,但口服抗生素同时会影响肠道正常菌群的建立,尤其是对于新生儿来说,正常肠道菌群对于维持机体稳态相比较于己经有一定免疫能力的成年人来说更是重要得多,因此目前已很少采用服用口服抗生素来预防NEC的发生。与此同时,近些年益生菌预防NEC的研究也很火热。直至Mori等人通过回顾性的研究分析了日本大阪1982至2006年NICU的NEC发生率与临床治疗策略的关系,发现母乳喂养、使用益生菌和避免脐静脉置管是降低NEC发生的主要原因。乳铁蛋白作为母乳中重要的蛋白成分,已被证实具有光谱的抗炎、抗氧化等对新生儿保护的作用,但由于人乳铁蛋白具有原料昂贵的特点,商品话存在一定的限制。牛乳铁蛋白具有与人乳铁蛋白70%以上的同源序列,且我国可利用牛乳加工奶酪时的副产物乳清进行加工提取牛乳铁蛋白,所以相对于从人乳中提取乳铁蛋白,利用牛乳生产商业化的牛乳铁蛋白原料极为丰富。综上所述,本研究拟从临床新生儿坏死性小肠结肠炎病理生理过程为切入点,利用肠道上皮细胞模拟体外细胞炎症模型,以此评价牛乳铁蛋白对肠上皮细胞的影响,尤其是在炎症模型下抗炎的作用,为天然药物研发及临床应用提供研究基础。目的1.探究牛乳铁蛋白对IEC-6细胞细胞活性的影响：2.研究牛乳铁蛋白对IEC-6细胞增殖能力的影响及机制；3.探讨牛乳铁蛋白在LPS体外诱导的IEC-6细胞炎症模型下对细胞炎症的影响及机制。方法1.细胞活性的检测MTT法检测bLF对IEC-6细胞线粒体活性的影响,MTT全称为3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,,是一种黄颜色的染料,活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO),俗称万能溶剂,能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪特定波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数目或细胞内线粒体的活性成正比。本实验通过比较牛乳铁蛋白处理与非处理组其吸光吸收值来比较细胞活性的变化。2.细胞增殖能力的检测Brdu,即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷,为细胞有丝分裂所必须需胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),用BrdU预处理的细胞中,BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中,而且这种置换可以稳定存在,并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后,可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记,最后用比色法或荧光的方法进行定量测定),从而判断细胞的增殖能力。3.流式细胞术细胞周期的检测细胞在增殖过程中,首先会发生DNA的复制,通过将荧光标记的碘化丙啶PI插入到DNA双链中,可以通过插入量来评价细胞内DNA含量,后通过流式细胞术来检测每个细胞中标记的荧光来评估细胞所处的细胞分裂时间段。4.实时荧光定量PCR细胞因子转录水平的检测实时荧光定量PCR技术就是指在普通PCR的反应体系中加入荧光基团,从而利用荧光信号累计来检测整个PCR过程,最后通过扩增曲线来检测特异靶基因的mRNA表达水平。在本实验中通过比较在LPS刺激下,相关细胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β)在IEC-6细胞中mRNA水平,从而评价bLF对抗炎症的效应。5. ELISA细胞培养上清中细胞因子的检测ELISA,即酶联免疫吸附试验,其原始是使抗原或抗体结合到96孔板固相载体表面,并在有效期内保持其免疫活性,后用使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(本实验中为细胞培养上清)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。通过用bLF(预)处理IEC-6细胞,或同时用LPS刺激IEC-6细胞,用商业化的ELISA试剂盒检测细胞培养上清中的IL-8、IL-6以及TNF-α的含量。6. Western blot检测信号通路激活及抑制情况MAKP,即丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是一种能被不同的细胞刺激因子刺激,如细胞因子、氧化应激、激素、炎症等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。所有真核细胞都能表达MAPK,其与MKKK、MKK、共同调节细胞的生长、对环境应激的适应以及炎症反馈等过程。NF-κB,是细胞自身防御、损伤应激、细胞分化和凋亡过程中重要的信息传递者。作为MAPK重要的下游分子,NF-κB是细胞多种损伤反应基因的调节因子,有大量的研究已经报道在静息状态下,NF-κB常与其抑制性蛋白I-κB蛋白结合并稳定存在于细胞胞浆中,p38被激活后可磷酸化I-κ B,进而I-κ B被降解,从而与NF-κB解聚,解聚后的NF-κB发生核转位,继而与DNA接触,启动或抑制有关基因的转录。通过比较bLF(预)处理IEC-6细胞后,LPS诱导的MAPK信号通路激活情况探究bLF抗炎的分子机制。7.统计学方法统计学比较用GraphPad Prism 5.01软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA),后多重比较组间差异用Newman Keuls方法,当P0.05被认为有统计学意义。结果1.bLF可显著提高IEC-6细胞的细胞活性；2.bLF通过调节细胞周期S期来促进IEC-6细胞增殖；3.bLF通过抑制LPS诱导的MAPK磷酸化激活,从而抑制NF-κB核转录调节IEC-6炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8的表达。结论牛乳乳铁蛋白可促进大鼠小肠上皮隐窝细胞株IEC-6的细胞活性及增殖能力,在LPS诱导的炎症反应中,牛乳铁蛋白可通过抑制MAPK磷酸化抑制NF-κB激活及核转位,从而抑制IEC-6相关细胞炎症因子的细胞内mRNA表达和细胞外分泌起到抗炎症效应,牛乳铁蛋白可能在未来治疗新生儿坏死性小肠结肠炎中发挥重要作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R722.1

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本文编号：1160632