p66Shc特异性慢病毒载体的构建及其对高氧诱导肺泡上皮细胞凋亡的影响

发布时间：2017-12-17 02:18

  本文关键词：p66Shc特异性慢病毒载体的构建及其对高氧诱导肺泡上皮细胞凋亡的影响

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【摘要】：目的：构建p66Shc特异性慢病毒载体,稳定转染至人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞中，抑制p66Shc的表达，并探讨其对高氧诱导肺泡上细胞凋亡的影响。 方法：设计3条p66ShcRNA干扰靶点，合成双链DNA，与双酶切后的慢病毒空载体进行连接，转化入感受态的细胞，鉴定阳性克隆正确后，抽提、扩增质粒，与另外3个辅助包装质粒进行慢病毒包装，测定滴度后感染A549细胞，，选取沉默效应最为明显的p66Shc-Shc1组进入后续实验，稳定培养一个月。同时体外传代培养慢病毒空载体感染的A549细胞及未做任何处理的A549细胞。将实验细胞分为四组：对照组，高氧组，慢病毒+高氧组，空载体+高氧组。对照组：在含10%胎牛血清和1%青链霉素的1640培养基中常规培养；高氧组、慢病毒+高氧组、空载体+高氧组：加入等量的上述培养液，换液后，以3L/min的速度通入含95%氧气的高纯混合气10min，后在培养箱中密闭培养。培养结束后收集细胞检测指标:倒置相差显微镜下观察A549细胞的形态学改变；流式细胞术检测高氧及慢病毒载体对细胞凋亡的影响；SP细胞免疫化学方法检测分组24小时后XIAP，Caspase-9蛋白的表达；激光共聚焦显微镜检测线粒体活性氧产生情况及膜电位变化情况。 结果：（1）p66Shc-pLenR-GPH载体的鉴定：将重组质粒及pLenR-GPH空载体以限制性内切酶双酶切后行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果与预期相符，LV-shRNA载体构建成功。（2）慢病毒的包装：将所构建的p66Shc-pLenR-GPH重组质粒及pLenR-GPH空载体与辅助包装质粒pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G共转染293T细胞，转染终止24小时后在荧光倒置显微镜下观察，每孔细胞均表达GFP绿色荧光，转染成功。（3）稳定沉默p66Shc基因的A549细胞系的建立：将浓缩后的病毒感染A549细胞，对感染后的A549细胞做荧光定量PCR及Western blot，3组细胞p66ShcRNA表达量降低，p66Shc蛋白的表达下降，p66Shc-Shc1组下降更为明显，表明我们已经成功建立了稳定沉默p66Shc的A549细胞系，并选取p66Shc-Shc1组进入后续实验。（4）倒置相差显微镜下观察细胞的形态学改变:对照组细胞贴壁良好，呈铺路石样，为典型扁圆多角形，数量多，排列紧密，悬浮细胞少。高氧组及空载体+高氧组细胞随时间延长，悬浮细胞数量增多，贴壁细胞生长缓慢，细胞形态由典型的扁圆多角形变成圆形或椭圆形，数量减少，连接松散，细胞间隙可见较多细胞碎片。慢病毒+高氧组细胞生长状态欠佳，部分细胞形态由典型的扁圆多角形变成圆形或椭圆形，活细胞数量较高氧组增多，悬浮细胞数量较高氧组少，但未达到对照组水平；（5）流式细胞术检测凋亡:与对照组相比，高氧组及空载体+高氧组细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义(p0.05)。而慢病毒+高氧组的凋亡率有所降低，与高氧组比较差异有统计学意义(p0.05)；（6）免疫组织化学方法检测凋亡相关蛋白的表达：与对照组相比，高氧组及空载体+高氧组细胞内XIAP表达减少，Caspase-9蛋白的表达明显增加，差异有统计学意义(p0.05)。而与高氧组相比，慢病毒+高氧组细胞内XIAP表达增加，Caspase-9蛋白的表达有明显降低，差异有统计学意义(p0.05)；（7）激光共聚焦显微镜结果：与对照组相比，高氧组细胞线粒体活性氧含量显著增加，膜电位明显下降，差异有统计学意义(p0.05)。而与高氧组相比，慢病毒+高氧组细胞线粒体活性氧含量显著减少，膜电位明显升高，差异有统计学意义(p0.05)，但未达到对照组水平(p0.05)。 结论：高氧诱导细胞内p66Shc出现高表达，发生磷酸化，转位于线粒体，线粒体活性氧产生增多，膜电位下降。靶向表达p66Shc的shRNA慢病毒载体，转染入人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞内，可通过RNA干扰导致p66Shc基因沉默，减少线粒体活性氧产生，减轻膜电位下降，减少A549细胞凋亡，减轻肺泡上皮细胞的损伤。而慢病毒空载体组则没有这种变化。
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R722.6

【参考文献】

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1 车忠丽;董文斌;李清平;雷小平;康兰;郭琳;翟雪松;陈枫;;PKCβ/p66Shc氧化应激通路介导高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡的作用[J];临床儿科杂志;2013年11期

本文编号：1298370