EV71毒力表型差异与氨基酸突变关系的研究

发布时间：2017-12-19 07:55

  本文关键词：EV71毒力表型差异与氨基酸突变关系的研究

  更多相关文章： EV71 反向遗传学 3C蛋白酶 毒力位点

【摘要】：肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是引起儿童手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)的重要病原。感染EV71后大多数患儿表现的症状较为轻微,如手足口部位的疱疹或疱疹性咽峡炎(Herpetic angina,HA);少数患儿能够发生严重的中枢神经系统(Central nervous system,CNS)炎症等并发症,如脑炎、脑膜炎、肺水肿甚至死亡。目前EV71感染致使CNS炎症损伤机制并不完全明确。多数研究表明,由EV71感染引起临床症状轻重的不同,一方面与被感染者身体免疫水平有关,也与病毒本身毒力强弱有关,即病毒基因组内可能存在毒力相关位点。课题组前期在临床分离得到6株不同毒力表型的EV71毒株,经动物实验分为强毒株组与弱毒株组,经测序发现两组不同毒力的毒株基因组内部发生了多处核苷酸的变异,并且引发了编码区内8处氨基酸发生了变化(结构蛋白VP3-I537V,VP1-S639G;非结构蛋白2A-P937 S/C/G,2B-V1014A,2B-I1062T,3C-V1597I,3C-N1617D和3D-V2146A)。为明确病毒毒力的差异是否是由于这些变异位点造成的,并且探明这些突变点与病毒毒力的关系,试验选取编码区内的8处变异位点作为研究对象,在EV71全长cDNA感染性克隆(A12质粒)基础上逐一构建了相应的突变株病毒的感染性克隆并进行了病毒拯救,并对拯救病毒突变前后在细胞上的复制能力作比较。结果发现位于3C蛋白酶上的nt5591(3C-N69D)位点突变后病毒复制能力明显降低,甚至无法在RD细胞上进行传代。为进一步明确nt5591位点变异致使病毒复制及感染能力降低的原因,我们对突变体3C蛋白进行了结构的模拟和分析,发现突变点临近酶的活性中心,突变使活性中心的构象发生变化,可能会对3C蛋白的功能造成影响。为验证猜想,我们将课题组前期在原核体系中克隆表达的对应nt5591突变点的3C蛋白突变体(3C-N69D),在体外通过酶活实验与野生株3C蛋白进行了酶活性的比较,结果显示突变体蛋白3C-N69D与野生3C蛋白相比其活性显著降低,切割不同底物多肽的能力分别下降了5-10倍。试验结果表明,nt5591位点的突变造成其所在的3C蛋白酶活性下降,使其剪切病毒多聚蛋白的效率降低,从而抑制了病毒的复制,是造成两组毒株毒力不同的根本原因。目的:运用反向遗传学的方法,构建针对编码区变异位点的8株EV71突变体感染性克隆并进行病毒拯救,通过比较病毒突变前后复制能力的变化,找出对病毒性状的改变产生作用的突变点,进而明确这两组毒力不同的EV71毒株的编码区内8处氨基酸的变异是否与病毒复制或毒力有关,并深入探寻变异位点影响病毒复制或毒力的机制。方法:1.在EV71全长cDNA感染性克隆(A12质粒)基础上,利用Quikchange方法构建针对编码区的突变株cDNA感染性克隆,将其按照在编码区的顺序依次命名为M1-M8(由重株向轻株进行突变),并进行突变株病毒的拯救,将得到的拯救病毒M1-M8在核酸水平(RT-PCR)和蛋白水平(western blot、间接免疫荧光实验)进行性质检测,并在RD细胞进行传代验证;绘制拯救病毒的生长曲线并分析突变点对病毒复制能力的影响,找出能影响病毒复制的关键位点。2.进一步探寻致使M7株突变体病毒复制能力下降的原因。通过生物信息学手段分析突变位点对3C蛋白的影响,设计EV71-3C蛋白酶的多肽底物,通过酶活性实验检测突变体3C-N69D的活性变化情况,并结合实验结果阐述突变与病毒毒力之间的关系。结果:1.成功构建了8株针对编码区变异位点的突变体cDNA感染性克隆并在RD细胞上进行拯救尝试,除M7(突变点nt5591位于3C蛋白酶)和M8(突变点nt7179位于3D蛋白酶)外所有拯救病毒均能稳定传代,生长曲线与未突变前相比无明显改变;突变株M7和M8转录本RNA转染细胞后虽能表达病毒特异蛋白,但将转染复合物继续传代后无法在细胞上产生细胞毒性效应(Cytopathogenic effect,CPE),且不能在RD细胞上传代;M7和M8回复突变验证结果显示,M7经回复突变后病毒恢复了野生株的生物学性状,而M8的回复突变体病毒仍不能使细胞产生CPE现象也不能进行传代。2.通过结构分析可知,突变点紧靠3C蛋白酶活性中心,N69D的突变造成了催化三联体的构象发生改变,可能影响酶的活性;酶活试验结果显示,突变体蛋白3C-N69D与野生株3C蛋白相比切割底物的能力下降了5-10倍,酶活性显著下降。分析得知N69D的突变极有可能是通过抑制3C蛋白酶的活性进而阻碍病毒的复制功能。结论:位于编码区3C蛋白的nt5591位点的变异是造成试验中两组病毒株毒力不同的根本原因;变异位点引起3C蛋白酶活性中心构像发生变化,使酶的活性显著降低,切割底物效率下降,抑制了病毒的复制,可能是病毒的毒力相关位点。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R725.1

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李鹏;李志会;岳盈盈;宋楠楠;纪璇;张颖;盖中涛;孟红;;不同毒力EV71济南分离株全基因组序列比较分析[J];中国病原生物学杂志;2013年10期

2 汪六庆;徐海红;;EV71病毒致病机制的研究现状[J];安徽医学;2013年03期

3 刘娟;李康;杨静;王升启;;肠道病毒71型(EV71)ICR乳鼠动物模型的建立[J];军事医学;2011年11期

4 郭淑珍;孙波;王世平;周浩;唐道州;;哈尔滨市手足口病重症病例212例分析[J];中国公共卫生;2011年10期

5 张慧娟;朱汝南;钱渊;邓洁;赵林清;王芳;邓莉;张艳玲;;2008至2009年北京地区分离的肠道病毒71型全基因组序列分析[J];中国循证儿科杂志;2011年01期

6 刘威龙;韦清;杨桂林;喻爽;张明霞;陈心春;刘映霞;李晶晶;王威;高杨;周伯平;;深圳5例肠道病毒71型手足口病病毒株全基因组测序分析[J];中华微生物学和免疫学杂志;2010年05期

7 ;A Comparison of the Biological Characteristics of EV71 C4 Subtypes from Different Epidemic Strains[J];Virologica Sinica;2010年02期

8 潘浩;朱叶飞;祁贤;张永杰;李亮;邓斐;吴斌;王慎骄;朱凤才;汪华;;江苏省2008年某福利院手足口病暴发的流行病学和病原学特征研究[J];中华流行病学杂志;2009年04期

9 龚黎明;葛琼;严菊英;卢亦愚;冯燕;茅海燕;李敏红;周敏;;浙江省肠道病毒71型的分离与VP1区域序列分析[J];中华流行病学杂志;2005年12期

10 崔爱利,许文波,李秀珠,胡家瑜,凌华,唐伟,杨智宏,张燕,陈立,Hiroyuki Shimizu;肠道病毒71型的RT-PCR诊断及基因特征[J];病毒学报;2004年02期

，

本文编号：1307439