青少年特发性脊柱侧凸致病基因定位及影像学研究

发布时间：2018-01-28 00:52

本文关键词：青少年特发性脊柱侧凸全基因组关联分析单核苷酸多态性遗传学易感基因青少年特发性脊柱侧凸 LBX1 Wnt/β-catenin信号通路病因学青少年特发性脊柱侧凸 GPR126 单核苷酸多态性遗传学病因青少年特发性脊柱侧凸　出处：《南京大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第二章(第一节)全基因组关联分析定位汉族AIS致病新基因目的本研究在既往全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)研究的基础上,进一步增加病例量和健康对照量,寻找新的中国汉族人群青少年特发性脊柱侧凸(Adolescent idiopathic scoliosis,AIS)相关的单核苷酸多态性位点(Single nucleotide polymorphism,SNP),定位易感基因,探究AIS发病的机制。方法纳入2009-2016年于中国南京、香港、杭州、长春等地就诊并采集血样的AIS患者5201例和健康对照6787例。从全血提取基因组DNA,使用Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片进行基因分型及全基因组关联分析,通过三阶段实验筛选出AIS相关的SNPs,进一步定位易感基因和致病信号通路。使用PLINK软件计算最小等位基因频率、检验Hardy-weinberg平衡,使用EIGENSTRAT软件进行群体分层分析,使用Haploview软件进行病例-对照关联分析。全基因组显著性差异P值定位5 x10-8。结果群体分层分析结果显示AIS组及对照组均来自中国汉族人群,基因组膨胀系数为1.13,无明显群体分层现象。经过质量控制后,共有435183个SNPs纳入统计学分析,第一阶段的病例-对照关联分析纳入1456例AIS和2104例正常对照。第一阶段筛选出56个潜在阳性的SNPs位点,剔除连锁位点和既往已报道的位点,剩余24个SNPs位点进行验证实验。经过两个阶段的验证实验,最终筛选出4个AIS显著相关的SNPs,包括2p14上的rs7593846,3p14.1上的rs7633294,3q26.2 上的 rs9810566 和 20p11.22 上的 rs6047663,这 4 个 SNPs 所在区域内对应的基因分别为MEIS1、MAGI1、TNIK和PAX1。结论本研究发现了新的中国汉族人群AIS易感位点,包括2p14的rs7593846,3p14.1 的 rs7633294,3q26.2 的 rs9810566,此外,还发现一个 AIS 易感位点rs6047663位于20p11.22,该区域与既往白种人AIS的GWAS研究结果一致。通过这些位点进一步定位了一批AIS易感基因:MEIS1、MAGI1、TNIK和PAX1,其中的TNIK、MEIS1、MAGI1,以及既往GWAS研究发现的LBX1、PAX3等基因与Wnt/β-catenin信号通路密切相关,以上基因及信号通路的发现对今后中国汉族人群AIS的发病机制的研究具有重要意义。第二章(第二节)Wnt/β-catenin信号通路在青少年特发性脊柱侧凸发病机制中的研究目的我们前期基于大样本的全基因组关联研究发现的一系列AIS易感基因如LBX1、PAX3、TNIK和MEIS1等,均位于Wnt/β-catenin信号通路下游。然而AIS患者这些基因表达是否存在异常,其受何种调控因素影响等仍然未知。本研究旨在探究Wnt/β-catenin信号通路下游各基因在AIS发病中的作用。方法共入选124名行后路矫形内固定手术的AIS汉族女性患者,手术取顶椎区椎旁肌组织。对照组1由20名Chiari畸形伴脊柱侧凸的女性患者组成,手术取顶椎区椎旁肌组织。对照组2由24名非脊柱畸形的女性患者组成,手术取L5两侧椎旁肌组织。从肌肉中提取RNA和蛋白,通过实时荧光定量PCR技术和Western Blot 技术检测β-catenin、TNIK、TCF4、PAX3、LBX1、MyoD、MEIS1、PAX1的表达,比较实验组和对照组之间、凹凸侧间的表达差异,分析各基因之间的相关性。取AIS病人凹凸侧椎旁肌行肌球蛋白ATP酶染色,免疫荧光检测Ⅰ、Ⅱ型肌纤维与MyoD的表达,比较凹凸侧Ⅰ、Ⅱ型肌纤维的百分比,并分析Ⅰ型肌纤维凹凸侧比与MyoD表达水平之间的相关性。结果三组对象年龄匹配,AIS组与Chiari畸形组Cobb角匹配。mRNA水平:AIS 组 β-catenin、TNIK、TCF4、PAX3、LBX1、MyoD、MEIS1、PAX1 的表达均低于对照组,且AIS组凹凸侧之间存在显著差异,均表现为凹侧小于凸侧,而对照组两侧无差异。此外,通路中大多数基因之间呈显著正相关。蛋白水平:AIS组β-catenin和LBX1的表达凹侧小于凸侧,且凹侧小于对照组。AIS病人顶椎区凹侧椎旁肌I型肌纤维比例显著低于凸侧(49.5%±8.0%vs.61.5%±7.7%,p=0.002),Ⅰ型肌纤维凹凸侧比与椎旁肌MyoD表达显著相关(r=0.67,p=0.02)。结论β-catenin,TNIK、LBX1、MyoD等基因在AIS患者双侧椎旁肌之间表达存在显著差异,且MyoD的表达与凹凸侧肌纤维比例异常相关。本研究首次揭示了 Wnt/β-catenin信号通路与AIS发病的潜在关系,对AIS发病机制的研究具有重要意义。第二章(第三节)GPR126基因多态性与青少年特发性脊柱侧凸关联分析及功能研究目的探讨GPR126基因多态性位点rs9403380与青少年特发性脊柱侧凸(AIS)发病的相关性,进一步分析rs9403380是否为GPR126基因的功能性调控位点。方法共入选975例AIS患者(135男,840女)和1049例正常青少年对照(151男,898女),收集其血样和影像学资料。从全血中提取DNA,通过Taqman探针对rs9403380位点进行基因分型,比较不同基因型和等位基因在AIS组与对照组之间的分布差异。手术取48例AIS患者顶椎区椎旁肌组织和10例青少年腰椎间盘突出患者L5两侧椎旁肌组织及血样本,从肌肉中提取RNA和蛋白,通过实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测GPR126的表达,比较AIS组与对照组GPR126基因的表达情况,进一步分析rs9403380位点不同基因型的AIS患者GPR126的表达是否存在差异。结果AIS组GPR126基因rs9403380位点的基因型及等位基因分布与对照组比较有显著差异(p=0.005和0.001),其等位基因C为风险基因(OR=1.16,95%CI=1.05-1.27)。椎旁肌GPR126表达AIS组显著高于对照组(p0.001),风险基因型CC的AIS患者的GPR126表达显著高于基因型TT的AIS患者(p=0.011)。结论GPR126基因多态性位点rs9403380与AIS发生相关,该位点为GPR126基因的功能性调控位点。第三章(第一节)青少年特发型脊柱侧凸前柱过度生长:原发还是继发?目的应用多层螺旋CT多平面重建技术(Multiple Planar Reconstruction,MPR)测量青少年特发性脊柱侧凸(AIS)患者的椎体形态,并与Chiari畸形I型(Chiari I malformation CMI)伴脊柱侧凸患者及健康青少年的椎体形态测量结果相比较,探究AIS患者是否存在前后柱异常发育,进一步分析该现象为AIS发病的原发因素还是继发因素。方法纳入60例AIS Lenke I型患者(AIS组),52例年龄、性别和Cobb角相匹配的Chiari畸形伴胸弯患者(Chiari组),30例年龄、性别相匹配健康青少年志愿者(对照组)。对入选对象进行多层螺旋CT胸椎扫描,采用3D-MPR技术测量胸椎椎体的各项参数,包括椎体前缘高度、后缘高度、椎体中心横径,椎弓根高度等,并用椎体前缘高度比上椎弓根高度代表前后柱高度比,比较三组各参数之间的差异。结果AIS组与Chiari组的T2-T12节段椎体前缘高度均显著大于对照组,T1-T12各节段椎体后缘高度均显著大于对照组,AIS组T4-T10节段、Chiari组T6-T10节段椎弓根高度显著小于对照组,但AIS组与Chiari组各参数之间无显著差异。三组椎体中心横径无显著差异。椎体前缘高度或椎体后缘高度比上椎弓根高度,AIS组与Chiari组均显著大于对照组,两组间无显著差异。结论与正常对照相比,AIS组与Chiari组均表现为前柱过度生长,且两组之间无显著差异,两组前柱过度生长可能有相同的发病因素。因此,AIS患者前柱过度生长可能是AIS发病的继发因素。第三章(第二节)Lenke 1A型青少年特发性脊柱侧弯远端融合椎的选择目的既往研究表明选择远端触及椎(last touching vertebra,LTV)作为青少年特发性脊柱侧弯(adolescent idiopathic scoliosis,AIS)矫形术的远端融合椎(lowest instrumented vertebra,LIV)可获得较好的效果并保留更多的运动节段。本研究将LTV进一步分为充分触及椎(Substantially Touched Vertebra,STV)与非充分触及椎(non-Substantially Touched Vertebra,nSTV),比较选择不同的 LIV(nSTV,nSTV+1,STV)对Lenke1A型AIS患者后路选择性内固定融合疗效的影响,并分析与术后远端附加现象(adding-on)发生相关的因素。方法纳入104例自2006年7月至2012年7月在我院诊断为Lenke 1型AIS患者,行后路选择性融合手术并至少随访两年。STV定义为骶正中线位于两侧椎弓根之间或穿过一侧椎弓根的触及椎;nSTV定义为骶正中线位于椎弓根边缘与同侧椎体边缘之间的触及椎。依据LIV选择的不同将病人分为nSTV,nSTV+1与STV三组,比较三组术前、术后和末次随访时的影像学参数,并进一步分析与术后adding-on发生的相关因素。结果在末次随访时,共有23例患者(22.1%)发生adding-on。nSTV组adding-on发生率显著高于 STV组(66.7%vs.10.0%,P0.01)与nSTV+1 组(66.7%vs.11.6%,P0.01)。与adding-on发生相关因素包括:LIV与STV/nSTV+1之间相差节段数,术前上胸弯度数与矢状面平衡(SVA),术后腰弯度数、顶椎偏移距离、躯干偏移距离和影像学双肩高度差。进一步通过逻辑回归分析确定与adding-on发生相关因素为:LIV与STV/nSTV+1之间相差节段数(LIV-STV0或LIV-(nSTV+1)0,OR=27.1,95%CI=2.3-311.2,P=0.002)。结论将LTV划分为STV与nSTV有助于LIV的选择。LIV与STV/nSTV+1之间相差节段数与术后adding-on的发生密切相关。选择STV或nSTV+1作为LIV可减少术后adding-on的发生,使Lenke1型AIS患者获得良好的矫形效果。
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【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R726.8

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