儿童白血病病人特异性诱导多能干细胞（iPSCs）样细胞株的建立及其生物学特性研究

发布时间：2018-02-01 15:22

  本文关键词： iPSCs MSCs ESCs cMyc Klf4 Lin28 Nanog Sox2 Oct4 重编程 白血病 表达　出处：《浙江大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景及目的 急性白血病是儿童时期最常见的血液系统肿瘤,约占该时期所有恶性肿瘤的35%。随着危险分组治疗的开展、化疗方案的进步和支持治疗的改善,ALL长期无病生存率可达70%～80%,而AML的长期无病生存率可达50%左右。但仍有部分病例早期复发或治疗失败,HSCT是该部分患者的最佳选择。但造血干细胞移植的成败与HLA的配型密切相关,如果HLA不相合,便可能会发生严重的排异反应,甚至危及生命。目前国际上推荐首选HLA匹配相关供者的HSCT,但由于80%的儿童白血病患者缺少这种供者,auto-HSCT也被选择性地应用于白血病的治疗。auto-HSCT的不足之处是白血病的复发率高,移植治疗后复发的原因主要是自体移植物中残余的白血病细胞(其中还可能包括极少量的白血病干细胞)随着移植物再次输入人体内以及移植后无移植物抗白血病(GVL)效应。为此,寻找一种全新的非肿瘤细胞来源的自体干细胞进行移植对于降低移植后白血病复发具有重要的科学意义和临床应用前景。 iPSCs细胞具有类似于ESCs的多向分化特性,在特定的诱导条件下既可向造血干/祖细胞分化,也可向成熟的血细胞如红细胞、单核细胞和NK细胞等分化。为此,诱导产生白血病病人特异性的iPSCs或许将对白血病的治疗带来新的突破。 要成功地诱导产生病人特异性的iPSCs,应考虑如下几个问题：(1)选用合适的载体；(2)选用最适的转录因子；(3)适合重编程的靶细胞；(4)选用合适的能维持干细胞特性和促使干细胞分化的培养基。 通过病毒载体导入外源基因进行体细胞重编程获得iPSCs是目前最为常用的方法。尽管如此,病毒介导的重编程方法由于外源性基因和病毒骨架序列会永久地整合于靶细胞基因组内,并且转基因的反式激活会最终导致肿瘤的发生而限制了其临床应用。通过非病毒的方式或使用非整合的载体导入外源基因将体细胞诱导为iPSCs已经取得成功。尽管如此,体细胞重编程至今尚无普适性的载体。 鉴于需要导入一定数量的转录因子基因后方能有效地进行体细胞重编程,为此,目前有许多关于不同转录因子组合进行体细胞重编程的研究。iPSCs最先是通过逆转录病毒导入4个转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和cMyc或Oct4、Sox2、Lin28和Nanog)诱导产生的。后来,导入3个转录因子(Oct4、Sox2和Klf4)或2个转录因子(Oct4和Sox2或K1f4)甚至单个转录因子(Oct4)即可成功诱导产生iPSCs亦可见报道,但未见采用单个Oct4基因导入能获得人类iPSCs的报道。可见Oct4是体细胞诱导iPSCs所不可或缺的转录因子。 选择合适的靶细胞进行重编程是另一个非常重要的问题。这些靶细胞应当易于获得和易于在体外培养增殖。这些细胞包括淋巴细胞、单核细胞、NK细胞以及来自于外周血或皮肤的成纤维细胞、来自骨髓的间充质干细胞以及来自血管的内皮细胞等。将人脐血来源的内皮细胞(endothelial cell, ECs)、动员的外周血干/祖细胞以及非动员的外周血T淋巴细胞等重编程诱导产生iPSCs已有报道。尽管如此,目前有关将来源于白血病病人的体细胞重新编程后获得iPSCs方面的文献鲜有报道,尤其利用儿童白血病病人体细胞进行重编程研究则未见报道。MUELLER LP等研究表明从化疗后的骨髓标本中同样可分离到足够数量且符合临床应用的间充质干细胞(mesanchymal stem cells, MSCs)[22]。可见,将白血病病人骨髓来源的MSCs作为诱导产生病人特异性的iPSCs的靶细胞不无可能。 本研究试图将白血病病儿骨髓来源的MSCs重编程成为iPSCs,分析其生物学特性,探索其向CD34+和/或CD45+的细胞分化的可能性及方法,并盼望通过该研究能为将来白血病的个体化治疗提供新的治疗方法。 本研究主要包括以下三个部分：(1)iPSCs相关转录因子基因在白血病细胞中的表达、基因的克隆及载体构建；(2)人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)的培养、鉴定及生物学特性分析；(3)hBM-MSCs来源的iPSCs样细胞株的建立及其生物学特性鉴定。 方法 1iPSCs相关转录因子基因在白血病细胞中的表达、基因的克隆及载体构建 1.1iPSCs相关转录因子基因在白血病细胞株及白血病细胞中的表达谱研究：通过RT-PCR和Real-Time PCR检测9个白血病细胞株包括KG1a,Meg-01,HL-60,K562,U937,Molt-3,Molt-4,Nalm-6和Raji以及53例白血病标本中iPSCs相关转录因子基因(包括Oct4.Sox2.c-Myc.Klf4.Lin28和Nanog)的表达情况。经知情同意将取自9例ITP病人的骨髓标本作为对照。 1.2诱导多能干细胞相关转录因子基因的克隆及序列分析：根据基因表达谱研究结果,设计包含酶切位点的引物,通过RT-PCR扩增各转录因子基因的ORF序列,经测序比对后,将序列克隆至pGEM?-T载体。 1.3诱导多能干细胞相关转录因子基因真核表达载体的构建：通过酶切、连接反应,将克隆至pGEM?-T载体的序列插入至真核表达载体pcDNA3.1。 2人骨髓间充质干细胞(hBM.MSCs)的培养、鉴定及生物学特性分析 2.1hBM-MSCs的培养和鉴定：通过全骨髓培养和密度梯度离心相结合的方法分离获得MSCs,采用流式细胞术检测MSCs表面抗原的表达情况。 2.2hBM-MSCs的类ESCs生物学特性分析：通过RT-PCR和Real-Time PCR检测检测MSCs中iPSCs相关转录因子基因表达；通过流式细胞术和免疫荧光法检测MSCs中多能性标记物如SSEA4.TRA.1-60.TRA-1-81等的表达情况。 3hBM-MSCs来源的iPSCs样细胞株的建立及其生物学特性鉴定 3.1稳定表达Oct4蛋白的hBM-MSCs细胞的建株：将真核表达载体pcDNA3.1/Oct4转染MSCs,通过多轮亚克隆筛选出稳定表达Oct4的细胞株；通过RT-PCR、Real Time PCR、免疫荧光法、流式细胞术和Western Blot检测Oct4的表达。 3.2稳定表达Oct4蛋白的MSCs (MSCs-Oct4)的生物学特性研究：通过免疫荧光法和流式细胞术检测MSCs-Oct4细胞中ESCs多能性标志物的表达情况；通过RT-PCR和Real Time PCR检测MSCs-Oct4细胞中Nanog和Sox2基因的表达。 3.3不同转录因子组合瞬时共转染MSCs的转染效率分析：分成4种不同的转录因子组合(均含定位蛋白GFP),连续两次瞬时共转染MSCs,流式检测瞬时转染时ESCs多能性标志物的表达情况；通过定位蛋白的表达情况比较不同组合的转染效率。 3.4hBM-MSCs来源的iPSCs样细胞的鉴定及其生物学特性研究：免疫荧光法、流式细胞术和Western Blot检测ESCs多能性标志物的表达情况；通过碱性磷酸酶染色、端粒酶活性、拟胚体形成和畸胎瘤形成试验鉴定MSCs来源的iPSCs样细胞的生物学特性。 3.5MSCs来源的iPSCs样细胞向造血系细胞定向分化：在特定造血生长因子包括IL-3,IL-6, Flt-3Ligand,SCF, G-CSF和BMP4的作用下,诱导MSCs来源的iPSCs样细胞向CD34+和／或CD45+的细胞分化,流式检测CD34+和／或CD45+的表达阳性率,RT-PCR检测CD34和／或CD45基因的表达。结果 1iPSCs相关转录因子基因在白血病细胞中的表达、基因的克隆及载体构建 1.1iPSCs相关转录因子基因在白血病细胞中的表达谱研究:RT-PCR结果表明,9/9个细胞株表达cMyc和Lin28基因；3/9细胞株(U937、K562和HL60)表达K1f4基因；2/9细胞株(Molt-3和K562)表达Oct4基因；2/9细胞株(KG1a和Meg-01)表达Nanog基因；3/9细胞株(KG1a、Meg-01和Raji)低水平表达Sox2基因。53/53例标本中检测到cMyc基因表达,16/53例标本中检测到Klf4表达,20/53例标本中检测到Lin28低水平表达,11/53例标本中检测到Sox2、低水平表达,7/53例标本中检测Oct4极低水平表达,3/53例标本中检测到Nanog基因表达。 Real Time PCR结果显示,与对照组(N=9)相比,白血病细胞株组(N=9)cMyc基因表达上调(P=0.012),而Klf4(P=0.001)和Sox2基因(P=0.010)则表达下调,两组间差异具有显著意义。而Nanog(P=0.08)、Lin28(P=0.882)和Oct4基因(P=0.456)的表达两组间差异无显著性。iPSCs相关转录因子基因包括cMyc、Klf4、Lin28、Nanog、Oct4和Sox2在白血病细胞株中的平均相对表达量分别为4.63±8.51%、0.45±0.51%、0.014±0.023%、0.004±0.006%、0.083±0.085%和0.45±0.51%。髓系和淋系细胞株在cMyc(P=0.063),Klf4(P=0.111)和Sox2(P=0.286)三个基因的表达量方面无统计学意义。 与对照组(N=9)相比,白血病组(N=53)cMyc表达上调(P=0.001),而Klf4(P=0.04)则表达下调。Sox2(P=0.266)、Nanog (P=0.237)、Lin28(P=0.769)和Oct4基因(P=0.93)的表达,对照组和白血病细胞组间差异无显著性.iPSCs相关转录因子基因包括cMyc、Klf4、Lin28、Nanog、Oct4和Sox2在白血病细胞株中的平均相对表达量分别为3.49±3.78%、0.83±0.38%、0.33±1.29%、0.83±0.38%、0.009±0.036%和0.83±0.38%。AML(N=26)和ALL(N=27)两组在cMyc(P=0.803)和Klf4(P=0.098)两个基因的表达量方面也无统计学意义。 1.2iPSCs相关转录因子基因的克隆及序列分析：分别以KGla、Nalm-6和Meg-01细胞cDNA为模板,均可扩增出1320bp左右的单一cMyc基因条带和630bp左右单一Lin28基因条带,相应的PCR产物经测序后与理论序列完全吻合；分别以KGla和Meg-01细胞cDNA为模板,均可扩增出918bp左右的单一Nanog基因条带,送测序发现存在6个碱基突变,其中3个无意突变,3个有意突变；以U937细胞cDNA为模板,扩增出1413bp左右的单一Klf4基因条带,PCR产物经测序后与理论序列完全吻合；以畸胎瘤cDNA为模板,扩增出954bp左右的单一Sox2基因条带,PCR产物经测序后与理论序列完全吻合；分别以肝脏组织和睾丸肿瘤cDNA为模板,均可扩增出1083bp左右的单一Oct4基因条带,测序发现有很多碱基突变。通过SOE的方法将Nanog基因中的3个有意突变进行了回复突变。通过TA克隆系统将上述测序正确的各转录因子基因克隆至pGEM?-T载体。 1.3iPSCs相关转录因子基因真核表达载体的构建：通过酶切、连接反应,将克隆至pGEM?-T载体的各转录因子基因插入至真核表达载体pcDNA3.1通过人工合成的方法合成Oct4序列,并将其插入至真核表达载体pcDNA3.1和peGFP-N1,经测序,插入的各转录因子基因序列完全正确。 2人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)的培养、鉴定及生物学特性分析 2.1hBM-MSCs的培养和鉴定：流式结果表明,第10代之前的hBM-MSCs均强表达CD29,CD105,CD166和CD44,共检测3次,平均阳性率分别为95.89±2.20%,97.40±1.56%,96.94±1.45%和95.67±0.89%；第5代之前的hBM-MSCs均较强表达CD90,平均阳性率为93.88±5.08%,P5代后的hBM-MSCs弱表达CD90,hBM-MSCs不表达CD34,CD38,CD14,CD19和HLA-DR,其平均阳性率均5%。 2.2hBM-MSCs的类ESCs生物学特性分析：PCR结果显示,MSCs仅内源性表达Sox2基因；免疫荧光和流式结果显示内源性表达Sox2,其表达平均阳性率为16.70%。极低表达ESCs其它的多能标志物Oct4. Nanog、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81(其平均阳性率不到5%)。 3hBM-MSCs来源的iPSCs样细胞株的建立及其生物学特性鉴定 3.1稳定表达Oct4蛋白的hBM-MSCs细胞(MSCs-Oct4)的建株：3轮亚克隆后Oct4的表达阳性率分别为49.99%、70.75%和94.66%,而对照组MSCs其Oct4的表达阳性率为1.72%；免疫荧光显示胞核内Oct4的表达,Western Blot显示MSCs-Oct4细胞存在大小约为45kDa的蛋白条带。Real-Time PCR结果显示,MSCs-Oct4细胞(转染68d后)内源性Oct4和总Oct4基因的相对mRNA表达量分别是未转染MSCs细胞的6.23和7.20倍。 3.2MSCs-Oct4的生物学特性研究：流式结果显示,MSCs-Oct4细胞其Nanog和Sox2的平均表达水平分别从未转染时的0.61%和12.33%增加至40.61%和96.21%；SSEA-4, TRA-1-60及TRA-1-81的表达阳性率分别从未转染时的8.21%、1.72%和2.53%增加至90.77%、64.62%和71.70%。Real-Time PCR结果显示,与未转染的MSCs细胞相比较,hBM-MSCs-Oct4细胞其Nanog和Sox2的相对mRNA表达量分别增加了8.68和2.13倍；免疫荧光显示胞核内Nanog和Sox2的表达。 3.3不同转录因子组合瞬时共转染MSCs的转染效率分析：随着转录因子数目的增加,转染效率逐渐下降；仅转染一个转录因子(1TF)时绿色荧光最强,6个转录因子(6TF)共转染时荧光最弱。6TF、5TF、3TF和1TF瞬时共转染hBM-MSCs时多能性标志物SSEA-4的表达阳性率分别为86.10%、74.16%、75.79%和89.41%；TRA-1-60的表达阳性率分别为32.66%、33.20%、38.55%和42.77%；TRA-1-81的表达阳性率分别为17.24%、39.25%、34.07%和64.97%。 3.4hBM-MSCs来源的iPSCs样细胞的鉴定及其生物学特性研究：MSCs来源的iPSCs样细胞边界清晰,核质比高,碱性磷酸酶染色和端粒酶活性检测均阳性；体外培养时可形成拟胚体,表达三个胚层的基因SPARC、Brachyury、 TBX20、TUBB3和WNT1；分化第21天时多能性标志物SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81表达阳性率分别从90.77%、64.62%和71.70%降至4.25%、3.07%和1.69%。MSCs来源的iPSCs在裸鼠体内能产瘤,瘤体切片HE染色显示为未分化的干细胞。 3.5MSCs来源的iPSCs样细胞向造血系细胞定向分化：MSCs来源的iPSCs样细胞在造血生长因子包括IL-3,IL-6,Flt-3Ligand,SCF, G-CSF和BMP4的作用下,能向CD34+和CD45+的细胞分化,分化培养第20天其表达阳性率分别为26.22%和26.03%；RT-PCR检测到CD34和CD45的基因条带；甲基纤维素半固体培养基内培养14时观察到CFU-GM样的集落形成。 结论 1、成功地将儿童白血病骨髓MSCs诱导成为具有多能性的iPSCs样细胞； 2、单个Oct4转录因子转染MSCs能有效上调Nanog和Sox2的表达,并能诱导人iPSCs样细胞的产生； 3、在多种细胞因子存在下体外培养儿童白血病HuBM-MSC来源的iPSCs样细胞能向CD34+和CD45+的造血系细胞分化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R733.7

【参考文献】

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1 曹志成;;白血病的综合治疗新进展[J];白血病.淋巴瘤;2007年04期

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3 王跃春;张洹;;人胚胎骨髓间充质干细胞的增殖能力及其向三个胚层起源细胞分化的特性[J];生理学报;2008年03期

4 曹晖;;白血病的发病及治疗进展[J];实用医技杂志;2007年16期

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本文编号：1482179