以cpsB基因测序为主的序贯分子生物学方法检测肺炎链球菌血清型及临床应用研究

发布时间：2018-02-11 23:35

本文关键词： cpsB基因测序肺炎链球菌血清型序列型优化的序贯mPCR 肺炎链球菌血清分型血清型特异PCR 肺炎链球菌血清6群 cpsB测序 mPCR 血清型特异PCR 肺炎链球菌血清型　出处：《南方医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：肺炎链球菌性疾病(pneumoniae diseases, PDs)已成为全球一个重要的公共卫生问题。肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia, SP)始终是导致婴幼儿脑膜炎、菌血症、肺炎等严重疾病的首位病原菌,也是引起鼻窦炎和急性中耳炎的最常见病因。2000年全球疫苗和免疫联盟研究估计了全球5岁儿童肺炎链球菌疾病的疾病负担,指出共有10个国家涵盖了全球PDs病例的66%,其中印度27%,中国12%(位居第二)。该研究同时估算出中国每年有174万儿童患PDs,死亡人数为3万人。侵袭性肺炎链球菌性疾病(invasive pneumococcal diseases, IPDs)是造成肺炎链球菌性疾病重症和死亡的主要原因。2010年亚太地区IPDs负担报告指出除澳大利亚和新西兰,其他地区的大多数研究仅针对住院患儿,故PDs发病率报告常低于实际水平。美国的数据显示2007年之前儿童患肺炎链球菌性中耳炎、败血症及脑膜炎的病例每年大约共计500万。沉重的疾病负担使得WHO将预防PDs作为发达国家和发展中国家的重点工作,并将PDs列为优先使用疫苗预防的感染性疾病。肺炎链球菌的荚膜不仅是重要的毒力因子,还具有型特异性,根据其荚膜多糖结构不同,可将肺炎链球菌分为46个血清群,95个血清型。接种肺炎链球菌疫苗是特异性的预防措施。7价肺炎链球菌疫苗(seven-valent pneumococcal conjugate vaccine, PCV-7)是由7个常见血清型(4,6B,9V,14,18C,19F,23F)的多糖抗原与白喉类毒素载体蛋白CRM197结合构成,为T细胞依赖性抗原,能刺激小儿免疫系统产生足够的保护性抗体,并具有免疫记忆。自2000年在美国上市以来,目前已在90多个国家或地区应用,监测表明PCV-7可降低儿童IPDs的整体发病率。接种PCV-7可预防疫苗所覆盖的7种血清型肺炎链球菌引起的IPDs,但不能预防疫苗覆盖血清型之外肺炎链球菌的感染。在广泛使用疫苗后的监测研究表明,非疫苗血清型(non-vaccine types, NVT)定植、致病增多,在分离株中所占比例增高的现象称为血清型替换(serotype replacement)。伴随着血清型替换,NVT其耐药性也有所增强。除此之外,还存在着疾病替换(replacement disease)及某些疾病类型发生变化等。随着NVT引起IPDs的日益增多,许多国家通过引入增加更多价血清型的肺炎链球菌疫苗来应对血清型替换,10价肺炎链球菌疫苗(ten-valent pneumococcal conjugate vaccine, PCV-10)和13价肺炎链球菌疫苗(thirteen-valent pneumococcal conjugate vaccine, PCV-13)等纷纷面世。随着更多价肺炎链球菌疫苗逐步推广持续开展肺炎链球菌血清型监测、疫苗保护后血清型变迁以及耐药性变化等显得尤为重要。肺炎链球菌血清分型的经典方法为荚膜肿胀试验(Quellung reaction),但操作较复杂,全套试剂昂贵,显微镜下的形态观察存在一定的主观性,对操作人员的技术要求较高,因而限制了它在临床微生物实验室和流行病学研究中的应用。我国目前只有北京、上海、广州等少数大医院开展此项分型技术。近年来分子生物学技术迅猛发展,应用分子生物学技术对肺炎链球菌血清型进行鉴定,是目前研究热点之一。常见的分型方法有测序,多位点序列分型技术(multilocus sequence typing, MLST),实时PCR,多重PCR,反向线点杂交技术(reverse line blot hybridization, RLB),限制性片段长度多态性(RFLP),微阵列技术等,这些分子生物学方法在血清型检测中表现出良好的应用前景,同时也各有利弊。例如RLB杂交仅利用一张具有45个航道的尼龙膜可同时检测43个样本的43个靶基因,且该尼龙膜可重复20余次使用,而敏感性并不降低。从标本DNA提取到RLB检测出结果约需14-16小时。对于靶目标数量及快速诊断其足以满足流行病学和诊断需要。但它对引物和探针的设计要求较高,且需要特殊设备,这些都限制了它的推广。微阵列方法是一个高通量的技术,但它费用昂贵,不适合在资源贫瘠但发病率高的不发达国家／地区开展。其它诸多分子生物学方法为了增加敏感性和特异性,需要大量血清型特异性引物以增加覆盖的血清型数目,这同时也增加了这些方法的多步骤和复杂性。Leung等学者设计一对特异性引物(cps1/cps2)应用单步PCR方法扩增cpsB基因、测序,可检测46个血清型,并建立了一个SP血清型cpsB基因序列数据库。受当时从事研究时间所限,Leung及其同事建立的数据库未涵盖目前所有95个血清型。众所周知,由于肺炎链球菌容易在基因水平发生重组、变异等,应用测序方法对于混合血清型、新的基因序列型难以准确识别。美国疾病预防和控制中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)推荐序贯多重PCR(sequential multiplex PCR,mPCR)是目前最常使用的分子生物学鉴定血清型的方法之一,己被广泛采用并显示较好的准确性尤其对常见血清型的检测与传统方法符合率较高。但其操作相对复杂,需要进行8个mPCR反应。它主要优点是不同地区可以根据各自血清型分布特征对mPCR 反应体系中的引物进行优化重组,从而在最初几个mPCR反应中检测到常见血清型。现有的多价肺炎链球菌疫苗是否适合于我国,取决于我国临床分离的肺炎链球菌菌株血清型,尤其是侵袭性SP血清型的分布情况。我国临床分离的SP血清型报道有限,与传统的血清型检测方法不能普及,暂时又缺乏一种实用、简单、适合中国国情的分子生物学检测血清型方法有关。既往研究报道主要集中在大城市、儿童医院,缺乏更广阔区域、尤其是直接来自农村或单个社区的资料。鉴于此,本研究主要目的是以国内儿童肺炎链球菌血清型分布状况为基础,以分子生物学方法为手段,建立一种简单、实用、适合发展中国家使用的肺炎链球菌血清型检测“鸡尾酒”策略,即将cpsB基因测序辅以优化的序贯mPCR及血清型6A-6D特异PCR相结合,并将该策略运用于肺炎链球菌临床株血清型的测定,结合耐药性检测,对评价本地区疫苗的覆盖率和有效性,指导合理临床用药提供更好的流行病学证据。第一部分cpsB基因测序检测肺炎链球菌血清序列型目的利用已建立的cpsB基因测序方法对我们临床收集的肺炎链球菌株进行血清序列型检测,同时建立涵盖目前已知肺炎链球菌95个血清型cpsB基因序列型数据库,将该方法进一步完善,提高检测的准确性。材料与方法下载GenBank中收录(截止2015年1月1日)肺炎链球菌所有cpsB基因全长的序列,应用GenBank中的ClustalW软件和/或JBlastn软件对下载的序列进行列对、比对分析,建立肺炎链球菌95个血清型cpsB基因序列型数据库。对2009年～2013年收集的我院5岁以下住院儿童中肺炎链球菌性疾病不同样本来源不重复肺炎链球菌菌株193株,用特异性引物cpsl/cps2进行单步PCR扩增cpsB基因目的片段,继之进行双向测序。测序结果与GenBank中的序列进行比对,参照我们建立的cpsB基因序列型数据库中数据确定血清型序列型。结果我们建立的数据库包括GenBank中(截止2015年1月1日)所有的390个含cpsB基因全长的GenBank收录号,包含目前所知肺炎链球菌95个血清型cpsB基因732bp标准序列型的数据资料。所有193株临床分离的肺炎链球菌菌株进行cpsB基因扩增均成功。基于cpsB基因在一个或多个位点的异质性,一共识别出21个序列型。其中8个序列型(3,9V,6B,10B,14,19A,23F,23A)是血清型特异序列型,可以由序列型直接预测出菌株的血清型：5个序列型(6C-6D,6B-6E-6X,15B-15C,19F-19A及28F-28A)是同一个血清群不同血清型共享序列型,可以由序列型直接预测出菌株相应的血清群；3个序列型(13-20,15A-33B,17A-34)虽然也属于多个血清型共享序列型,但无法明确菌株具体属于哪个血清型。通过cpsB基因测序方法,193株菌中34.2%的菌可直接确定其血清型；55.4%的菌可确定至相应血清群水平。结论本研究建立的肺炎链球菌95个血清型cpsB基因序列型数据库对分子生物字万法检测血清序列型是一个补充和完善。应用单步PCR进仃cpsB基因测序确定肺炎链球菌血清序列型可以作为血清型检测的初筛。第二部分优化的序贯nPCR方法检测肺炎链球菌血清型目的根据我国儿童肺炎链球菌血清型分布状况,对美国CDC推荐的序贯mPCR方法进行优化组合,建立一个适合我国儿童血清型检测的序贯mPCR方法,可以在最初三个nPCI反应中识别出最常见血清型。材料与方法采用优化的序贯mPCR方法对收集的193株菌进行肺炎链球菌血清型检测。参照美国CDC网站公布的引物序列合成肺炎链球菌40对血清型特异性引物和1对荚膜特异性引物。根据我国儿童肺炎链球菌血清型分布状况,对美国CDC推荐的序贯mPCR前三步反应中引物进行优化组合。优化后的前三步mPCI反应可识别十个血清群/型,包括我国儿童最常见血清群/型19F,19A,14,23F及6,PCV-7中包含的三个血清型4,9V/9A及18C,以及近些年在血清型替换中越来越受到关注的血清型15B/15C和15A/15F。第一步mPCI反应包含血清群/型9V/9A、14、23F、15B/15C的特异性引物；第二步mPCR反应包含血清群/型4,6和19A的特异性引物；第三步mPCR反应包含血清型15A/15F,18C和19F的特异性引物。每一步mPCR反应中均加入荚膜特异性引物作为内部阳性对照。如果一个标本在前三步mPCR反应中检测均阴性,则需要按照美国CDC推荐的方法进行序贯8个mPCR反应。结果从193株临床肺炎链球菌菌株中一共识别出肺炎链球菌12个血清群／型,包括：3(2株),6(27株),9W9A(3株),14(14株),15F/15A(2株),15B/15C(13株),19F(67株),19A(23株),20(2株),23F(33株),23A(2株)和34(1株)。血清型4和18C在本研究中没有该型菌株,故扩增阴性。通过优化的序贯mPCR前三步反应可识别大多数菌株的血清型,仅11株菌(5.7%)需要进行美国CDC推荐的序贯8步nPCR反应鉴定,其中4株菌(2.1%)改用后者依然不能进行分型。序贯mPCR方法无法分型的4株菌中2株菌cpsB基因测序显示序列型为10B,28F-28A。另有2株菌应用两种方法均无法分型,需要进行荚膜肿胀试验鉴定。cpsB基因测序与mPCR结果相比,两者一致性可达92.2%。cpsB基因测序提示序列型是15A-33B,13-20A-20B,17A-34,序贯mPC确定其血清型分别为15F/15A,20以及34,并证实13株肺炎链球菌cpsB基因血清序列型为新的序列型。结论根据中国儿童血清型分布状况,优化的序贯mPCR反应用于肺炎链球菌血清分型可以弥补基因测序的不足,提高检测准确性,并且在前三步mPCR反应中识别出常见血清型。第三部分血清型6A-6D特异PCR方法检测血清6群肺炎链球菌目的应用我们已建立的血清型6A-6D特异PCR方法对cpsB基因测序及序贯mPCR识别出的肺炎链球菌血清6群菌株进一步细分其血清型。材料与方法收集cpsB基因测序及序贯mPCR方法均鉴定为血清6群的27株肺炎链球菌菌株DNA。用特异性引物wciP584aS/wciP-r(6B)和wciP584gS/wciP-r(6A),通过单步PCR扩增wciP基因,初步将血清6群菌株区分为血清型6A/6C与6B/6D；对血清型6A/6C与6B/6D菌株,用特异性引物wciNβS1/wciNβA2再次采用单步PCR扩增wciNβ基因,从6A/6C与6B/6D中分别区分血清型6C与6D菌株。结果27株cpsB测序和序贯mPCR方法均鉴定为血清6群的肺炎链球菌,我们采用血清型6A-6D特异PCR细分血清型,发现12株血清型6A(12/27,44.4%),13株6B(13/27,48.1%),2株6C(2/27,7.4%),没有发现6D菌株。结论本研究再次证实血清型6A-6D特异PCR方法能快速、简单、有效的区分血清6群肺炎链球菌。第四部分cpsB基因测序辅以mPCR、血清型6A-6D特异PCR检测肺炎链球菌血清型的“鸡尾酒”策略及临床应用目的应用cpsB基因测序辅以优化的序贯mPCR、血清型6A-6D特异PCR的肺炎链球菌血清分型“鸡尾酒”策略,对我院临床收集193株肺炎链球菌进行血清分型,并对耐药性进行检测。旨在寻找一种适合于我国流行病学调查和研究的肺炎链球菌血清分型策略,并提供直接来自社区的肺炎链球菌血清型、耐药性、疫苗覆盖情况等资料。材料与方法收集2009年～2013年我院5岁以下住院儿童中肺炎链球菌性疾病的肺炎链球菌193株。首先采用cpsB基因测序初筛,确定血清序列型；对cpsB基因测序有歧义的结果或不能分型、新的cpsB序列型菌株应用优化的序贯mPCR方法明确血清型；对上述方法确定为血清6群的菌株应用血清型6A-6D特异PCR方法细分血清型6A,6B,6C和6D。将本次研究中发现新的cpsB基因序列上传GenBank。采用K-B法对193株菌进行抗菌素药物敏感试验,根据美国临床和实验室标准委员会(CLSI)2013年版标准进行判读。结果193株肺炎链球菌中共识别出16个血清型,分布情况如下：19F(34.7%),23F(17.1%),19A(11.9%),14(7.3%),15B/15C(6.7%),6B(6.7%),6A(6.2%),9V/9A(1.6%)；血清型6C,3,15F/15A,23A及20(各1.1%)及10B,28F/28A及34(各0.5%)。PCV-7和PCV-10覆盖率均为67.4%,PCV-13覆盖率为86.5%。但2岁以下儿童中PCV-7和PCV-10覆盖率增至70.6%,PCV-13覆盖率高达92%。cpsB1基因测序对193株菌初筛,34.2%菌株可预测至血清型水平,55.4%菌株可预测至血清群水平。初筛后,59.5%菌株序列型的结果需要进一步采用优化的序贯mPCR方法给予明确。大多数菌株血清型在序贯mPCR的前3个反应中可以识别,仅5.7%的菌株需要进行8个mPCR反应。多重耐药菌比例高达86.8%,最常见耐药模式：红霉素十克林霉素十复方新诺明。按非脑膜炎标准未检测出耐青霉素肺炎链球菌,按脑膜炎标准和口服标准对青霉素耐药性显著增加,分别为88.6%和39.2%。结论 (1)对国内尚无法采用传统荚膜肿胀试验进行SP血清分型的地区,本研究建立的cpsB基因测序辅以优化的序贯mPCR、血清型6A-6D特异PCR的“鸡尾酒”策略是一个值得推广的分子生物学检测策略；(2)血清型19A已经成为南方沿海地区一个常见的血清型；PCV-13血清覆盖率高,可为本地区儿童提供更好的免疫保护；血清15群(尤其15B/15C)的比例高于国内其它地区报道值得引起关注；(3)小于5岁儿童肺炎链球菌多重耐药比例高,应避免使用红霉素、克林霉素和复方新诺明治疗PDs,对非脑膜炎SP感染临床医生仍可选用青霉素,避免选择压力,保护三代头孢菌素敏感性,脑膜炎SP感染则需参考药敏结果选择敏感抗生素。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R725.1;R440

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