SHR大鼠脑内不饱和脂肪酸组成分析及哌甲酯对注意定势转移能力及脑内脂肪酸的作用探讨

发布时间：2018-03-01 02:16

本文关键词： 注意定势转移 Morris水迷宫开场实验 SHR DHA AA 气相色谱分析 MPH 注意定势转移不饱和脂肪酸　出处：《山东大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：注意缺陷／多动障碍(attention-deficit hyperactivity disorder, ADHD)是学龄期儿童最常见的行为障碍之一,严重影响儿童的身心健康及学业成绩。主要表现为与年龄不相符的注意力缺陷、多动、冲动等行为障碍。这类人群如果不能得到及时的诊断和有效的治疗,10%-60%的ADHD患者症状会持续到青春期后,出现焦虑障碍、学习困难、品行障碍以及反社会人格等,给家庭和社会带来沉重的负担。因此,ADHD已经越来越引起人们更广泛地关注。建立理想的动物模型对于研究ADHD的病因和发病机理有重要意义。为了研究ADHD的神经生物学和生理机制,虽然有许多动物模型存在,但是自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rat, SHR)仍然是目前选择最多的用来研究ADHD不同行为参数的动物模型之一。WKY (Wistar-Kyoto, WKY)大鼠同样由wistar远交系大鼠培育而成,常常被选择为SHR的对照组,但是,最近WKY被发现具有不稳定的行为特征,如常被作为抑郁症的动物模型,又因为WKY和SHR同来自于近亲交配的一个品系,其两者的遗传异质性在研究中需要被重新考虑。因此对WKY做为SHR对照组的身份遭到了质疑,因此,在本实验中我们选择SD大鼠(Sprague-Dawley rats, SD)作为另一个对照组,对三种大鼠进行注意定势转移实验(Attentional set-shifting Test, ASST)、Morris水迷宫实验和开场实验来更全面的判断SHR的行为特征,以确保科学的严谨性。注意定势转移是一种执行功能,是指人有意识、有计划、有目的地根据新任务的需要,主动自觉地调整注意力从一种维度转移到另一种维度,这种转移能力代表了行为灵活性。当这种转移能力受到损伤时,表现为持续应答发生,也就是不能从明确的改变中放弃以前的分类规则。持续应答反应了行为抑制的一种缺陷,常被用来诊断前额叶的功能障碍。大量临床研究已证实注意缺陷多动障碍儿童存在注意定势转移能力缺陷,但是至今在ADHD的动物模型上很少有研究,因此急需建立一个合适的反应ADHD儿童行为灵活性的动物模型以便更全面、深入的研究ADHD的病理状态。在整个儿童认知发育过程中,长链不饱和脂肪酸(Long-chain Polyunsaturated Fatty Acid, LC-PUFA)发挥着重要的作用。在生物膜中脂质成分约占40%～50%,其中PUFA是构成生物膜脂质结构极为重要的成分,并且影响着细胞膜流动性、膜连接酶、受体或离子通道的功能,在脂肪细胞分化、视网膜及神经系统发育过程中调节各种酶的基因表达以及转录活性。膜磷脂中n-6/n-3不饱和脂肪酸的比例是否恰当也直接影响着生物膜的正常活性和生理功能。目前有大量研究已经探讨不饱和脂肪酸和ADHD儿童之间的关系。流行病学和临床所见均认为低n-3不饱和脂肪酸饮食以及低n-3不饱和脂肪酸组织水平和ADHD的发生有相关性,并且有可能是导致本病的原因。但是,目前用来研究ADHD和PUFA的关系的动物模型较少,而且,通过这些动物模型显示的ADHD症状与PUFA临床观察的神经生物学特征无必要的相关性。为了更好地研究不饱和脂肪酸在ADHD发病过程中的作用,本实验通过对SHR大鼠各个脑区的不饱和脂肪酸含量进行测定,以及脑内不饱和脂肪酸和行为参数进行相关分析,试图建立一个完整的反应ADHD脑内不饱和脂肪酸分布的动物模型,为进一步对ADHD与不饱和脂肪酸的相关研究提供动物载体。哌甲酯(methylphenidate hydrochloride, MPH)是最常用来治疗ADHD的神经兴奋药物,然而,哌甲酯对ADHD儿童注意定势转移的作用的心理行为检测有不同的结果。我们知道,哌甲酯对认知的影响是个倒U型剂量反应曲线,在较低的剂量哌甲酯可以减少运动、冲动和增加认知功能,相反,高剂量可以损伤认知功能,并引起过度活动。那么不同剂量的哌甲酯对ADHD的动物模型SHR大鼠的注意定势转移能力的作用如何呢?有待我们进一步研究。大量的研究发现某些药物如锂等可以改变膜磷脂上DHA或AA的转换率,从而改变膜磷脂不饱和脂肪酸的含量,那么哌甲酯可以使脑内不饱和脂肪酸的含量和比率有所改变吗?因此,我们设计该课题进行了以上相关方面的研究。第一部分 SHR/WKY/SD大鼠的行为学特征检测目的增加SD大鼠作为另一种SHR大鼠的对照组,系统观察ADHD动物模型幼年SHR大鼠的行为灵活性、冲动性、自主活动性以及空间学习及记忆能力等方面的行为特征。方法清洁级SHR大鼠(实验组)、WKY大鼠(对照组)和SD大鼠(对照组)各8只,采用动物行为学观察方法,对SHR/WKY/SD三组大鼠进行注意定势转移实验、开场实验、Morris水迷宫实验,所有行为检测均用摄像机连续拍摄后离现分析。结果在注意定势转移实验中,8HR大鼠比WKY/SD大鼠潜伏期明显缩短(p0.001)。SHR大鼠比WKY/SD大鼠在完成任务过程中循环数在每一阶段都明显增加(p0.001),错误亚型分析显示SHR与WKY/SD大鼠比较出现更多的持续错误和退化错误(p0.001),说明SHR大鼠较其他两组对照组存在明显的冲动性以及注意定势转移能力缺陷。另外,三种老鼠的CD与ID之间有显著性差异(p0.001),WKY/SD的ID与ED之间有显著性差异(p0.001),而SHR的ID与ED之间没有显著性差异,说明我们所采用的注意定势转移实验方法适用于幼年大鼠进行行为灵活性的检测,同时还表明了SHR在本实验中不能很好地建立注意定势。在开场实验中,SHR与WKY比较在中央停留时间明显缩短(p0.001),穿越次数、直立次数、修饰次数明显增加(p0.001),与SD比较,只在中央停留时间有差异(p0.001)其余没有差异,WKY与SD比较在中央停留时间、穿越次数及直立次数具有显著性差异((p0.001)。说明SHR和SD大鼠同样具有多动的特性。在第一至四天的定位航行实验中,SHR与WKY比较找到平台的时间明显缩短,但与SD大鼠比较,除第一天外,其余时间均没有显著性差异。在第五天的空间探索实验中,SHR比WKY/SD在平台原来位置停留时间明显缩短(p0.001)。WKY与SD在定位航行实验及探索实验中没有显著性差异。说明SHR大鼠存在着空间记忆保持能力的缺陷。结论 1.SHR大鼠较WKY/SD大鼠存在明显的冲动性以及建立注意定势能力和转移注意定势能力的缺陷,这种缺陷是过度的持续反应和不能有效维持注意所导致的。 2.验证了我们所采用的注意定势转移实验方法适用于幼年大鼠进行行为灵活性的检测。 3. Morris水迷宫结果提示SHR大鼠较WKY以及SD大鼠在空间记忆保持能力上存在缺陷。 4.SHR大鼠活动水平明显高于WKY大鼠,但和SD大鼠之间没有差异,SHR大鼠在空间学习能力上优于WKY大鼠,但和SD大鼠之间没有显著性差异,因此,在对SHR大鼠进行行为研究时,增加SD大鼠作为另一种对照组更能客观的反应SHR大鼠的行为特征。意义再现了SHR大鼠在行为灵活性、冲动、多动、空间记忆能力上的行为缺陷,为进一步研究ADHD的发病机制及治疗提供了可靠的理论依据。第二部分 SHR/WKY/SD大鼠不同脑区的长链不饱和脂肪酸分析及与行为的相关研究目的对SHR/WKY/SD大鼠脑内多个脑区进行脂肪酸成分分析,并与行为实验参数进行相关研究,来探讨脂肪酸在ADHD发病过程中的作用。方法清洁级SHR大鼠(实验组)、WKY大鼠(对照组)和SD大鼠(对照组)各8只,行为实验结束后,立刻麻醉处死,迅速剥离脑组织,并将之置于冰袋上的玻璃培养皿内,参照大鼠脑立体定位图谱,冰台上迅速分离颞叶、小脑蚓部、顶叶、海马、纹状体、枕叶和胼胝体等脑组织,分别精确称重,置于-80℃备用。样品处理后进行甲酯化处理,然后通过气相色谱分析测定脑内不同部位脂肪酸含量。结果 SHR在各个脑区的DHA含量和AA含量均较WKY和SD大鼠高(p0.01),而DHA/AA比值在三种大鼠中反而最低,SD大鼠除前额叶DHA/AA比值在三种大鼠间比较最低外,其余脑区比值均是最高。通过将SHR大鼠脑内DHA/AA比率与开场实验的行为参数进行相关分析,发现颞叶(r=-0.777)、小脑蚓部(r=-0.873)、前额叶(r=-0.779)的DHA/AA比率和多动参数均呈负相关；纹状体的DHA/AA比率和粪便数呈负相关(r=-0.769)。颞叶(r=-0.758)、小脑蚓部(r=-0.761)和海马(r=-0.728)和定位航行试验中探索所用时间呈负相关；海马和呈空间探索实验中在原平台停留时间呈正相关(r=0.809),前额叶的DHA/AA比率和持续错误数(r=--0.703)及退化错误数呈负相关(r=-0.737)；纹状体和持续错误数呈负相关(r=-0.810)。结论 1.SHR脑内DHA、AA含量均比WKY、SD大鼠的增加,而DHA/AA的比值比两组对照组减低,说明了SHR脑内DHA/AA的比值降低可能是导致SHR大鼠行为异常的原因。 2.SHR的颞叶、小脑蚓部、前额叶的DHA/AA比值减低和其多动行为有相关性,纹状体的DHA/AA比值减低和焦虑情绪相关；颞叶、小脑蚓部、海马的DHA/AA减低和空间学习和空间记忆能力相关,前额和纹状体的DHA/AA减低和注意定势转移能力相关。 3.本实验为研究不饱和脂肪酸和ADHD的相关性提供了合适的动物模型。意义本研究第一次探讨了SHR大鼠与对照组在不同脑区不饱和脂肪酸含量的差别,并将脂肪酸含量和相应的行为进行相关分析,探寻脂肪酸在ADHD发病过程中起到的作用。第三部分不同剂量哌甲酯对注意定势转移能力和脂肪酸的作用目的探讨不同剂量(2.5mg/kg和5.0mg/kg)哌甲酯对注意定势转移能力以及对不同脑区域脂肪酸含量的影响。方法 3周龄SHR大鼠被自由分配到3个组：盐水组：SHR-vehicle(n=8),低剂量组：MHP-L (n=8)和高剂量组:MHP-H (n=8). MHP-L组每天给予哌甲酯2.5mg/kg,MHP-H组每天给予哌甲酯5mg/kg, SHR-vehicle给与生理盐水,均为腹腔注射,共14天,注意定势转移实验开始于5周龄。测试结束后按上法取得脑组织后进行脂肪酸分析。结果经过哌甲酯治疗后,两组治疗组大鼠比盐水组大鼠点食潜伏期延长(p0.001)。两组治疗组大鼠比盐水组大鼠在完成任务过程中循环数减少(p0.001),低剂量组比高剂量组减少更明显。其中治疗组老鼠的CD与ID之间有显著性差异, ID与ED之间有显著性差异,说明SHR大鼠经过哌甲酯治疗后能很好地建立注意定势。错误亚型分析显示治疗组大鼠与盐水组大鼠比较出现较少的持续错误和退化错误(p0.001),而非强化错误没有差异。MPH-H和MPH-L组的DHA和从及DHA/AA与SHR-vehicle组相比,没有统计学差异(p0.01) 结论小剂量哌甲酯可以明显改善注意定势转移能力。但是,2周的哌甲酯治疗不能改变脑内脂肪酸含量,这可能和哌甲酯对脂肪酸代谢的影响或用药时间有关。意义揭示了不同剂量哌甲酯能够改善SHR大鼠注意定势转移能力,但对脑内不饱和脂肪酸的影响甚微。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R749.94

【共引文献】