学龄前儿童乙肝疫苗免疫效果分析及相关免疫机制探讨

发布时间：2018-03-05 14:29

  本文选题：乙肝疫苗　切入点：免疫接种　出处：《浙江大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景和目的乙型肝炎病毒(HBV)感染的慢性化,以及在此基础上发展的肝硬化、原发性肝癌(HCC)严重威胁着国人的身心健康。我国是乙肝的高发地区,约有1.2亿人为HBV携带者,5岁以下儿童有1.0%。由于超过90%的围产期感染婴儿最终会发展为慢性感染,因此早期有效地预防,对最终控制HBV流行具有重要意义。接种乙型肝炎疫苗(HepB)是预防和控制乙型肝炎的有效措施,乙肝疫苗的问世和普及显著减少了慢性乙肝的发病率,甚至逐渐减少在高发区肆虐的HBV导致的肝硬化和HCC。我国早在20年前就已将乙肝疫苗预防接种纳入免疫规划管理,其近期保护效果也已被大量的应用证实。但在疫苗的使用中,仍存在着乙肝疫苗接种覆盖率及依从性的地区性差异,另一个更难以解决的问题是:疫苗接种后表现无应答或弱应答,即免疫失败。免疫失败者因不能受乙肝疫苗的有效保护,成为HBV感染的高危人群。本课题通过研究和探讨本地区学龄前儿童乙肝疫苗接种依从性、疫苗免疫的成功率,并进一步分析免疫细胞亚群变化与疫苗免疫效果的相关性,探明学龄前儿童乙肝疫苗应答的差异及其相关免疫因素,为当地儿童乙肝的预防与控制提供依据。对象和方法1研究对象研究纳入了 1965例来自浙江临安地区的学龄前儿童,采用随机抽样方法,对2015年1月至2016年5月至上述地区进行体检的入托或入学儿童的乙肝疫苗接种情况等进行问卷调查。并对其中813例进行了细胞免疫应答检测。2实验方法(1)调查表设计通过设计包含研究对象基本信息及乙肝疫苗接种史、乙肝家族史等相关信息的调查表,按照统一问卷调查,对每个调查对象及其父母或监护人进行面对面调查。(2)样本采集在现场调查的同时,签署知情同意书,对被调查的儿童采集静脉血2-5mL,及时运送至指定检测点(浙大一院),分离血清、PBMC,分别进行乙肝三系及细胞免疫应答指标检测。(3)HBV病毒学指标的检测及判断标准HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe及抗-HBc采用微粒子酶联免疫法(MEIA)检测。HBsAg≥0.05 IU/mL、HBeAg(s/co)≥ 1.000、抗-HBc(s/co)≥ 1.000、抗-HBe(s/co)1.000、抗-HBs ≥ 10 IU/L 为阳性(+)。乙肝疫苗免疫效果定义:HBV血清标志物均为阴性且抗-HBs10 IU/L,视为疫苗接种无应答;单纯抗-HBs阳性且10IU/L≤抗-HBs100IU/L,视为疫苗接种低应答;单纯抗-HBs阳性且抗-HBs≥100IU/L,视为疫苗接种高应答。(4)外周血淋巴细胞亚群的检测取100μl抗凝血置于各流式管中,加入CD3-PerCP-Cy5.5,CD4-APC,CD8-APC-Cy7 抗体各 20 μl,同时做相应的同型对照,混匀后,室温避光孵育30min,Coulter QPREP标本处理仪(美国Beckman coulter公司)进行红细胞裂解及细胞固定,在流式细胞仪(Coulter Cytomics FC 500,美国Beckman Coulter公司)上计数1×104以上细胞,分别记录CD3+、CD4+、CD8+T细胞占淋巴细胞的百分率。同理,通过CD19-APC-Cy7、CXCR5-FITC荧光抗体检测外周血B淋巴细胞群及滤泡辅助性T细胞(T follicular helper,Tfh)。(5)CD45RA、CD45RO细胞检测采用Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC),取100μlPBMC加入各管,然后依次加入20μl单克隆荧光抗体anti-CD45RO-PE、anti-CD45RA-FITC、anti-CD4-APC、anti-CD8-APC-Cy7充分混匀,避光,孵育15min;经洗涤后,加500μl PBS,振荡混匀,上机。以淋巴细胞设门,采用双色免疫荧光技术,分析淋巴细胞免疫表型CD4+CD45RO+、CD4+CD45RA+、CD8+CD45RO+、CD8+CD45RA+,每管细胞获取数目10000个,结果用EXP032(BeckmanCoulter)软件获取与分析数据。(6)ELISPOT检测Th1/Th2细胞相关因子采用ELISPOT法检测Th1/Th2细胞因子(IFN-γ、IL-2/IL-4、IL-5、IL-10)的变化。方法如下:调整PBMC浓度为1×106个细胞/ml,将其加入到抗体预包被的ELISPOT板上,100μl/孔,加入特异性刺激多肽,并设置阴阳性对照,加入10%FCS培养基,在37℃、5%CO2培养箱中孵育16-20小时;PBS洗涤后,加入相应的二抗抗体,避光室温孵育;再次洗涤后,加入酶标亲和素避光室温孵育,洗涤后加入显色液,室温避光孵育20min;加入终止液,洗板后用ELISPOT斑点计数仪进行斑点形成细胞计数(SFC)。(7)数据的统计学处理采用SPSS13.0统计软件中的相关方法。结果1学龄前儿童乙肝疫苗免疫效果调查分析(1)本研究共采集0-8岁人群血清标本1965例,其中资料完整者1695例,而按标准方案完成全程接种者1591例,乙肝疫苗接种率93.86%,男、女童接种率相似(93.68%vs 94.07%),0-2岁接种率95.34%(654/686),3-5岁接种率93.36%(914/979),6-8岁接种率76.67%(23/30)。(2)完成全程乙肝疫苗接种者,抗-HBs的阳性率为78.50%(1249/1591),0-2岁儿童抗-HBs阳性率高于3-5岁的(86.85%vs72.98%),3-5岁儿童抗-HBs阳性率高于与6-8岁儿童(72.98%vs 60.87%);不同性别的各年龄段儿童对疫苗应答率无差异。(3)母亲乙肝阳性的儿童未加强免疫的抗-HBs阳性率低,而加强免疫后的儿童抗-HBs阳性率则明显增高;家族他人乙肝阳性对儿童的应答率没有影响。2.2乙肝疫苗免疫后低应答和无应答者细胞免疫应答变化(1)纳入流式检测的813例样本中,1例HBsAg阳性,4例抗-HBc阳性,余下的808例中:193例血清抗-HBs滴度10 IU/L(无应答组);345例血清抗-HBs滴度10-100IU/L(低应答组);270例血清抗-HBs滴度≥100IU/L(高应答组)。(2)通过检测不同应答组外周血淋巴细胞、CD3+/CD4+/CD8+T细胞亚群,CD4+CD45RO+T 细胞、CD4+CD45RA+T 细胞及 CD8+CD45RO+T 细胞、CD8+CD45RA+T细胞的百分率发现,免疫无或低应答组CD8+T细胞、CD4+CD45RO+记忆性T细胞、CD8+CD45RA+效应性T细胞、Tfh细胞明显增多,与高应答组相比,差异有统计学意义(P0.05);而外周血淋巴细胞、CD4+T细胞、CD4+CD45RA+效应性T细胞在无或低应答组中低于高应答组,差异有统计学意义(P0.05);外周血CD3+T细胞、CD19+B细胞和CD8+CD45RO+记忆性T细胞在各组间差异无统计学意义。(3)各应答组间Th1/Th2细胞相关因子表达分析显示,免疫无应答或低应答组与高应答组相比Th1相关细胞因子IL-2、IFN-γ表达明显增多,而Th2相关细胞因子IL-4、IL-10表达减少明显,其差异有统计学意义(P0.05);而IL-5表达在各组间差异无统计学意义。结论本地区乙肝疫苗接种率总体较好、依从性较强;疫苗免疫效果随着年龄的增加逐渐降低,2岁到5岁间下降尤为显著;各年龄段不同性别间儿童对疫苗应答率相似;母亲乙肝阳性的儿童加强免疫后的儿童抗-HBs阳转率则明显增高,而家族他人乙肝阳性对儿童的应答率无影响。细胞免疫结果显示,学龄前儿童外周血淋巴细胞、CD4+/CD8+T细胞亚群、CD45RO+记忆性T细胞、CD45RA+效应性T细胞、Tfh细胞及Th1/Th2相关细胞因子存在明显差异,可能是影响基因重组乙肝疫苗免疫效果的机体内在因素。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R725.1
，

本文编号：1570626