SENP1特异性慢病毒载体的构建及其对高氧诱导肺泡上皮细胞凋亡的影响

发布时间：2018-03-10 03:15

本文选题：SUMO特异性蛋白酶1　切入点：RNA干扰技术　出处：《西南医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:构建SUMO特异性蛋白酶1(SENP1)RNAi慢病毒载体,建立SENP 1稳定低表达的人Ⅱ型肺泡上皮细胞(HEPApi C)细胞系。探讨人Ⅱ型肺泡上皮细胞(HEPApi C)高氧暴露后,细胞内SENP1与氧化应激诱导的细胞凋亡之间的关系。方法:实验分为两个部分进行:第一部分,构建LV3-SENP1-RNAi质粒,制备慢病毒颗粒并感染HEPApi C细胞,通过q RT-PCR及Western blot法检测SENP1在不同细胞分组中的表达情况。第二部分,将前期构建的SENP1-RNAi-HEPApi C细胞系作为研究对象,以高氧诱导HPAEpi C细胞损伤模型为基础,按3L/min的速度予以模型组制备好的高纯混合气(含900 ml/L O2和50ml/L CO2),持续10分钟。随机分组细胞为6组,即对照组、空载组、实验组、高氧组、高氧空载组、高氧实验组。对照组:HEPApi C细胞中直接加入含10%胎牛血清与1%青链霉素的DMEM高糖培养基,然后置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。空载组:慢病毒空载体稳定感染HEPApi C细胞中加入相同培养基与对照组同等条件培养。实验组:SENP1-RNAi-HEPApi C稳定细胞系加入相同培养基后与对照组同等条件培养。高氧组:HEPApi C细胞中加入相同培养基后依照高氧模型处理方式处理,即以3L/min的速度通入含900ml/L O2和50ml/L CO2高纯混合气10min,随后与前面三组同等条件培养。高氧空载组:慢病毒空载体稳定感染HEPApi C细胞中加入相同培养基后按照高氧组处理方式处理,随后同等条件培养。高氧实验组:SENP1-RNAi-HEPApi C稳定细胞系加入相同培养基后按照高氧组模型处理,后置于相同条件培养箱中培养。待细胞培养至12h、24h、48h,收集细胞,检测指标:(1)倒置相差显微镜观察各组细胞形态学改变并照相;(2)各组细胞培养24h,流式细胞技术检测细胞凋亡率;(3)各组细胞培养24h,免疫荧光检测SIRT1转位;(4)各组细胞培养24h,Western blot检测SENP1、SIRT1(胞质SIRT1、胞核SIRT1)、P53、AC-P53的表达。结果:第一部分,成功构建LV3-SENP1-RNAi慢病毒载体质粒,包装得到高滴度病毒颗粒并成功感染HEPApi C细胞。PCR结果显示:实验组中SENP1的2-ΔΔCt为0.026、,对照组SENP1的2-ΔΔCt为0.050,空载组SENP1的2-ΔΔCt为0.057。Western blot结果显示:实验组、对照组、空载组中SENP1蛋白相对表达量分别为0.161±0.015、0.781±0.046、0.811±0.008。与对照组及空载组相比,实验组SENP1在基因及蛋白水平表达均显著降低(P均0.05)。第二部分结果如下:(1)倒置相差显微镜下可见对照组、空载组、实验组三组细胞生长良好,贴壁可,分布均匀,多数细胞呈长梭形,培养液中悬浮细胞少。高氧组细胞生长情况差,细胞间距增大,贴壁不稳,多数细胞形态变圆,漂浮在培养液中。高氧空载组与高氧组情况类似,细胞变形,悬浮细胞多。高氧实验组细胞生长情况较差,与高氧组及高氧空载组相比,发生形态改变的细胞更少,培养液中悬浮细胞更少,但与对照组相比,高氧实验组悬浮细胞数是增加的。(2)流式细胞凋亡结果示:通氧24h后,细胞凋亡率明显增加,六组比较差异具有统计学意义(P0.05);对照组细胞凋亡率低于高氧组,空载组细胞凋亡率低于高氧空载组;实验组细胞凋亡率低于高氧实验组,三组分别比较,P0.05,差异均有统计学意义;高氧实验组细胞凋亡率低于高氧组及高氧空载组,但未达到对照组水平,差异有统计学意义(P0.05);高氧组与高氧空载组相比,P0.05,差异无统计学意义。(3)免疫荧光结果显示:细胞核呈蓝色荧光,SIRT1蛋白呈红色荧光,融合荧光呈紫色。与对照组、空载组、实验组相比,高氧组、高氧空载组、高氧实验组转位细胞数量明显增加,六组比较差异具有统计学意义(χ2=99.34,P=0.0000.05);与对照组相比,高氧组转位率明显增加,差异有统计学意义(χ2=45.36,P=0.0000.05);与高氧组相比,高氧实验组转位率明显降低,但未达到对照组水平,差异具有统计学意义(χ2=30.75,P=0.0000.05)。(4)与对照组相比,高氧组SENP1、总SIRT1、SIRT1(质/核)比值、AC-P53蛋白表达增加,P53蛋白表达降低;与高氧组相比,高氧实验组SENP1、总SIRT1、SIRT1(质/核比值)、AC-P53蛋白表达降低,均未达到对照组水平;与实验组相比,高氧实验组P53蛋白表达水平增高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:成功构建了SENP1基因沉默的HEPApi C细胞系。SENP1、SIRT1参与了高氧诱导的氧化应激反应,高氧诱导SENP1表达增加,SIRT1转位增加,使细胞核内SIRT1减少,细胞质内SIRT1增加,去乙酰化P53减少,AC-P53增加,细胞凋亡增加;稳定沉默SENP1基因后,SENP1表达降低,SIRT1转位减少,去乙酰化P53增加,AC-P53降低,细胞凋亡减少,从相反方向证明了SENP1在高氧导致HEPApi C细胞损伤中的促进作用。
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【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R722.1

【参考文献】