睾酮对青春期雄鼠糖脂代谢,血管损伤的影响及机制研究

发布时间：2018-03-28 14:44

  本文选题：青春期　切入点：肥胖　出处：《天津医科大学》2015年博士论文

【摘要】：目的:通过分子生物学方法,观察睾酮对青春期雄性大鼠糖脂代谢以及动脉损伤的影响,并以原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为研究对象,利用LPS制造血管内皮损伤模型,探讨含睾酮培养液对血管内皮细胞是否具有保护作用并基于PI3K信号通路探讨睾酮发挥作用的可能机制。方法:将21日龄SD雄性大鼠40只,(动物房保持12小时光照与黑暗的循环交替,每天7:30给予照明)断奶适应性饲养1天后,随机分为正常对照组(normal control group,NC),高脂组(high fat diet,FC),高脂+低剂量睾酮补充组(high fat diet+low dose testosterone,FLT)以及高脂+高剂量睾酮补充组(high fat diet+high dose testosterone,FHT),每组各10只。正常对照组给予普通饲料喂养,其他实验组均以高脂饲料喂养。饲养3周后,以高脂饲料喂养的大鼠体重超过正常对照组大鼠体重20%的定为成功造模的肥胖大鼠模型,其余未达标准的鼠弃去。各组大鼠均为42日龄(即青春期开始),FC组每日给予过滤除菌的花生油皮下注射,睾酮融于花生油中,制备成12.5ug/kg以及25ug/kg溶剂,FLT组每日给予12.5ug/kg睾酮皮下注射,FHT组每日给予25ug/kg睾酮皮下注射。给药共4周,期间各组大鼠均按原饲料喂养。生长至10周末,分别测量大鼠体重,禁食12小时后取内眦静脉血监测空腹血糖(Fasting blood glucose,FPG)、空腹胰岛素(Fasting insulin,FINS)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、睾酮(Testosterone,T)、雌二醇(Estradiol,E2),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)与非高密度脂蛋白(Non-high density lipoprotein,non-HDL)。取血后将各组大鼠处死,取各组大鼠腹主动脉,利用HE染色的方法观察各组大鼠腹主动脉的病理形态改变有无差别,采用免疫组化、western blot、PCR方法检测PI3K、IRS-1、AKT、GLUT-4、NF-κB、TNF-α在各组大鼠动脉壁中的表达含量。利用Tunel染色比较各组大鼠动脉壁细胞凋亡情况。进行统计学分析,比较各指标在四组大鼠中的表达是否具有统计学意义,并对睾酮浓度与各个生化指标进行相关性分析,根据r值大小明确睾酮与各个指标之间的相关程度。1mg/ml的II型胶原酶灌注消化法分离提取HUVEC细胞。达到80%以上贴壁融合后传代培养并鉴定,采用6代以内huvecs用于以下实验。分别以浓度为0ug/ml、1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml含lps培养液刺激6h、12h和24h后,用mtt法比较各组huvecs的增殖情况,根据结果选择合适的lps刺激浓度,建立细胞损伤模型。再采用六种梯度浓度的睾酮培养液,分为lps+10-6mol/lt组,lps+10-7mol/lt组,lps+10-8mol/lt组,lps+10-9mol/lt组,lps+10-10mol/lt组和lps+10-11mol/lt组,处理细胞,进行mtt、transwell小室迁移实验以及细胞划痕实验,根据结果选择最佳含睾酮培养液的浓度。以下实验选择最佳浓度的lps和含睾酮培养液,将细胞随机分为3组:正常对照组(control组)、lps模型组和lps+最佳浓度睾酮组。应用tunel试剂盒检测各组细胞凋亡情况,利用免疫荧光、western和pcr技术检测各组细胞内pi3k信号通路中各指标的表达水平。结果:1.fc组大鼠体型较nc组明显肥硕;fc组大鼠体重与nc组大鼠相比差异存在统计学意义,青春期肥胖大鼠造模成功(p0.05)。fc组大鼠空腹血糖、胰岛素、homa-ir、tc、non-hdl、e2显著高于nc组(p0.05),hdl、t显著低于nc组(p0.05),flt组大鼠空腹血糖、胰岛素、homa-ir、tc、non-hdl、e2显著低于fc组(p0.05),flt组大鼠hdl、t显著高于fc组(p0.05)。fht组大鼠空腹血糖、胰岛素、homa-ir、tc、non-hdl、e2显著高于nc组(p0.05),fht组大鼠空hdl、t显著高于nc组(p0.05)。2.he染色显示:nc组大鼠血管内皮和外膜边界清晰,内弹性模完整,血管壁薄厚均匀,血管各层细胞排列整齐;fc组与fht组大鼠血管内膜外膜边界欠清,细胞各层细胞排列紊乱,细胞核极性差;flt组大鼠血管内皮结构完整,各层细胞排列整齐。3.免疫组化、westernblot、pcr结果显示fc组、fht组pi3k、nf-κb与tnf-α的表达量明显高于nc组(p0.05),akt、irs-1与glut-4的表达量明显低于nc组(p0.05);flt组pi3k、nf-κb与tnf-α的表达量明显低于fc组(p0.05),akt、irs-1与glut-4的表达量明显高于fc组(p0.05)。4.相关分析显示:nc组、fc组与flt组fpg、fins、homa-ir、tc、non-hdl随睾酮的升高而下降,hdl随睾酮的升高而升高;fht组fpg、fins、homa-ir、tc、non-hdl随睾酮升高而升高,hdl随睾酮升高而下降。5.成功提取并培养huvec原代细胞,利用兔抗人viii因子抗体进行免疫组化染色鉴定,结果均为阳性表达。6.mtt结果显示10ug/ml浓度lps作用6小时可以使细胞生长受到抑制,与正常对照组相比具有显著性差异(p0.05),以10ug/ml浓度lps作用6小时制备内管内皮细胞损伤模型。7.mtt法、transwell小室以及细胞划痕实验表明,生理浓度睾酮培养液,即10-9mol/l睾酮培养液可以显著改善lps导致的血管内皮细胞活性以及迁移能力的下降(p0.05)。在达到生理浓度之前,睾酮对血管内皮细胞活性以及迁移能力的作用随浓度升高而提升,高于生理浓度时睾酮对血管内皮细胞活性以及迁移能力的作用随浓度升高而下降(p0.05)。8.tunel染色显示lps模型组细胞凋亡指数显著高于正常对照组(p0.05),lps+10-9mol/l睾酮培养液组细胞凋亡指数亦高于正常对照组,但显著低于lps模型组(p0.05)。9.细胞免疫荧光显示,与正常对照组相比较,lps模型组与lps+生理睾酮处理组的细胞内glut-4荧光强度表达显著下降,组间比较有统计学差异(p0.01);与lps模型组比较,生理浓度睾酮处理组的huvecs细胞内glut-4荧光强度表达显著升高,差异有统计学意义(p0.01)。与正常对照组相比较,lps模型组与生理睾酮处理组的细胞内nf-κb荧光强度表达显著升高,组间比较有统计学差异,与lps模型组比较,生理浓度睾酮处理组的huvecs细胞内nf-κb荧光强度表达显著下降(p0.001)。10.westernblot、pcr结果显示irs-1、akt和glut-4在正常对照组中表达丰富,在lps模型组中的表达较正常对照组明显降低,差异具有统计学意义(p�d0.05),在lps+生理浓度睾酮组中的表达较lps模型组明显增加(p�d0.05)。nf-κb、pi3k和tnf-α蛋白在正常对照组中表达不丰富,在lps模型组中的表达较正常对照组明显升高,差异具有统计学意义(p�d0.05),在lps+生理浓度睾酮组中的表达较lps模型组明显降低(p�d0.05)。结论:1.断乳21天幼鼠连续高脂饲料喂养3周,青春期肥胖大鼠模型可成功建立。高脂饮食喂养青春期大鼠可以引起睾酮水平下降、糖代谢异常、血脂紊乱、动脉壁呈损伤性病理改变。2.外源性生理剂量睾酮可以减轻高脂饮食造成的糖代谢异常、血脂紊乱、动脉壁病理损伤性改变;外源性高剂量睾酮会进一步加重糖代谢异常、血脂紊乱、动脉壁病理结构改变,说明外源性睾酮对肥胖青春期大鼠的作用有剂量依赖性。3.外源性睾酮对糖脂代谢以及动脉壁形态的作用可由PI3K/AKT信号通路介导。4.生理浓度含睾酮培养液可以有效改善LPS导致的血管内皮细胞活性降低、迁移能力下降以及凋亡指数增加等损害。5.睾酮对LPS刺激的HUVEC的保护作用在低于生理浓度时,存在浓度依赖作用;高于生理浓度时,睾酮的保护作用随浓度的增加而下降。6.睾酮对LPS刺激的HUVEC保护作用的机制与抑制NF-κB、PI3K和TNF-α表达,增加IRS-1、AKT和GLUT-4的表达有关。PI3K/AKT信号通路是睾酮保护血管内皮细胞的可能途径。
[Abstract]:Objective : To observe the effects of testosterone on glycolipid metabolism and arterial injury in adolescent male rats by molecular biological method . The rats were randomly divided into normal control group ( NC ) , high fat diet ( FC ) , high fat diet + low dose testosterone ( FC ) , high fat diet + low dose testosterone ( FC ) , high fat diet + low dose testosterone ( FHT ) . 鎬昏儐鍥洪唶(Total cholesterol,TC),楂樺瘑搴﹁剛铔嬬櫧(High-density lipoprotein,HDL),鐫鹃叜(Testosterone,T),闆屼簩閱，

本文编号：1676779