绿茶提取物和表没食子儿茶素没食子酸酯对口腔鳞状细胞癌细胞增殖及信号传导通路的影响

发布时间：2018-04-26 07:31

本文选题：绿茶提取物（GTE） + 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）　；参考：《吉林大学》2014年博士论文

【摘要】：目的：口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）位列恶性肿瘤的第6位，每年约有30万新发病例，62%患者发生在发展中国家，5年生存率不足50%，严重危害人类的生命健康。目前OSCC的治疗仍强调综合治疗模式，即以手术为主，辅以放化疗。但是化疗药物不仅作用于肿瘤细胞，同时也作用于正常细胞，存在剂量限制性毒副作用，并且有诱导肿瘤细胞耐药的可能。因此在天然药物中筛选研发高效、低毒的抗肿瘤药物是当前研究热点之一。绿茶是日常生活中颇受人们喜欢的饮料，近年研究发现绿茶提取物（green tea extract, GTE）具有较强的抗肿瘤活性，对皮肤癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌以及头颈部肿瘤等多种肿瘤具有预防和治疗作用，而绿茶对口腔鳞状细胞的研究较少。本研究探讨GTE及其主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate, EGCG）对3种人鳞状细胞癌细胞增殖的影响，并应用蛋白通路阵列技术（protein pathway array）研究其对信号传导通路的作用，同时应用人口腔上皮癌移植瘤模型，探讨GTE和EGCG对人口腔上皮癌小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用。方法：共进行3部分实验。在第一部分实验中，体外培养人CAL-27、SCC-25、KB细胞，应用不同剂量的GTE和EGCG作用于三种细胞，应用MTT法检测GTE和EGCG对细胞增殖的影响，筛选出敏感细胞。应用流式细胞术检测不同剂量的GTE和EGCG对敏感细胞细胞周期的影响，明确其抑制细胞增殖的机制。在第二部分实验中应用蛋白通路阵列（protein pathway array）技术检测GTE和EGCG对CAL-27、SCC-25、KB三种细胞蛋白表达的影响，并比较GTE和EGCG作用于不同细胞后蛋白表达的差异，明确其作用机制及所涉及的信号传导通路。第三部分实验为体内实验，将对GTE和EGCG敏感的细胞接种于NCR/Nu裸小鼠右肩背部皮下，移植瘤长至4-6mm后随机分为对照组、GTE组和EGCG组。GTE组：按50mg/kg灌胃，1次/日；EGCG组：按25mg/kg灌胃，1次/日；对照组：用等量生理盐水灌胃，1次/日。连续给药4周后，测量移植瘤体积及质量，计算裸鼠肿瘤生长抑制率，体内观察GTE和EGCG对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。结果：在第一部分实验中研究发现，GTE和EGCG对3种类型的人口腔鳞癌细胞均有抑制作用，并呈浓度依赖性。不同的细胞对GTE和EGCG的敏感性不同，GTE和EGCG对CAL-27的抑制作用最强。三种鳞癌细胞半数抑制浓度（IC50）分别为：GTE为70、125和145μg/ml（对应的EGCG浓度为35、62.5和72.5μg/ml），EGCG为59、102.5和102.5μg/ml，在EGCG浓度相同的情况下，GTE较EGCG对肿瘤细胞具有更强的抑制作用。不同浓度GTE（0、25、50和100μg/ml）、EGCG（0、12.5、25和50μg/ml）作用于CAL-27细胞，作用72h后流式细胞仪检测细胞周期水平，发现对细胞周期的影响主要是引起S期和G2/M期阻滞，G0/G1期细胞减少。在第二部分实验中应用GTE（100μg/ml）、EGCG（50μg/ml）分别作用于CAL-27、SCC-25、KB三种鳞癌细胞，处理细胞48小时后，提取总蛋白，应用蛋白通路阵列技术（protein pathway array）检测信号传到通路蛋白的表达。蛋白通路阵列技术共分析了107种与细胞增殖、凋亡及细胞周期相关的细胞通路蛋白，共发现46个蛋白在3种鳞状细胞癌表达，应用ANOVA分析，发现未经处理的3种细胞中23个蛋白表达明显异常。应用BRB分析软件显示SCC-25与KB细胞蛋白表达具有相似性，，可能揭示CAL-27细胞对GTE和EGCG敏感的原因。经GTE和EGCG处理48小时的CAL-27、SCC-25、KB细胞，经ANOVA软件分析共发现21个蛋白治疗前后表达异常。仅CDK6在3种细胞中均表达下调。虽然GTE和EGCG处理细胞后蛋白表达在细胞之间存在差异，但GTE和EGCG均可导致与细胞增殖相关蛋白表达下调。GTE和EGCG处理CAL-27细胞后p-PDK1、p-ERK、p-CDC2、CDK6、CDK4、CDK2、Cyclin E的表达下调；处理SCC-25细胞后p-PDK1、p-CDC2、CDK6、Cyclin E、cPKCα表达下调；处理KB细胞后CDK6和CDC2表达下调。经Western Blot确认了以下结果：在CAL-27细胞中GTE、EGCG对p-PDK1、CDK4和CDK6的表达抑制是呈剂量依赖性的。同时，GTE和EGCG也可导致一些与增殖相关的蛋白表达上调。GTE和EGCG处理CAL-27细胞后Notch4表达上调，处理SCC-25细胞后CDK2和CDC2表达上调，处理KB细胞后p-ERK、p-CDC2、CDK2、cPKCα、ERK1/2表达上调。GTE和EGCG处理细胞后，还可以观察到一些肿瘤抑制基因的表达下调（如p53、RB、PTEN）。不同鳞癌细胞的信号传导通路存在不均一性。GTE和EGCG作用于肿瘤细胞信号网络的多条信号传导通路而发挥抑制肿瘤生长的作用，其中EGFR通路是主要受影响的通路。GTE比绿茶中的单一成分（如EGCG）具有更好的抗肿瘤作用。在第三部分实验中应用GTE和EGCG敏感细胞CAL-27皮下植入裸鼠，通过体内实验我们发现GTE和EGCG对移植瘤的生长均有显著的抑制作用（P0.01），在具有相同含量EGCG的情况下，GTE对移植瘤生长的抑制作用较EGCG更为明显。结论： GTE和EGCG均能抑制人口腔鳞癌CAL-27、SCC-25和KB细胞生长。GTE和EGCG通过引起细胞周期G2/M期和S期阻滞来抑制口腔鳞癌细胞生长。3种鳞癌细胞的信号传导通路存在不均一性，不同细胞对GTE和EGCG的反应性存在差异，CAL-27细胞对GTE和EGCG的敏感性最高。3种人口腔鳞癌细胞用GTE和EGCG处理后，共有21种蛋白的表达水平发生改变，提示GTE和EGCG可以影响多种通路蛋白的表达，调控多条信号传导通路。GTE和EGCG对鳞癌细胞的作用可能主要影响EGFR通路，从而抑制细胞周期相关蛋白，进而抑制细胞增殖。动物实验表明GTE和EGCG能明显抑制人类口腔上皮癌异种移植瘤的增长。体外及体内实验均证明，在EGCG含量相同的情况下，GTE比EGCG具有更强的抗肿瘤作用。
[Abstract]:Purpose :

Oral squamous cell carcinoma ( OSCC ) is the sixth largest malignant tumor in the oral squamous cell carcinoma ( OSCC ) , with about 300,000 new cases per year . The 5 - year survival rate is less than 50 % in developing countries .

Method :

Three experiments were carried out in vitro . In the first experiment , the cultured human CAL - 27 , SCC - 25 and KB cells were cultured in vitro . The effects of GTE and GTE on cell proliferation were detected by MTT assay . The effects of GTE and GTE on cell cycle of sensitive cells were detected by flow cytometry , and the mechanism of inhibiting cell proliferation was defined .

In the second experiment , protein pathway array was used to detect the effects of GTE and EGG on the expression of CAL - 27 , SCC - 25 , KB in three cell proteins , and the difference of protein expression between GTE and egcg was compared . The mechanism of action and the signal transduction pathways involved were defined .

In the third part , the cells were inoculated on the right shoulder of the NCR / Nu nude mice , and the transplanted tumors were randomly divided into control group , GTE group and GTE group after 4 - 6 mm . GTE group : 50 mg / kg , 1 time per day ;
egcg group : gavage at 25 mg / kg once per day ;
Control group : After 4 weeks of continuous administration , the volume and mass of transplanted tumor were measured and the growth inhibition rate of nude mice was calculated . The effects of GTE and GTE on the growth of subcutaneous transplanted tumor in nude mice were observed .

Results :

In the first experiment , the inhibitory effect of GTE and GTE on three types of human oral squamous carcinoma cells was studied . The inhibitory effect of GTE and GTE on the tumor cells was strongest . The concentrations of GTE ( 0 , 25 , 50 and 100.mu . g / ml ) , EGTE ( 0 , 12.5 , 25 and 50 渭g / ml ) were the most effective . The effect of GTE ( 0 , 25 , 50 and 50 渭g / ml ) on the cell cycle was mainly caused by the arrest of S phase and G2 / M phase , and the G0 / G1 phase cells decreased .

In the second experiment , GTE ( 100.mu . g / ml ) was used in the treatment of three kinds of squamous cell carcinoma cells ( CAL - 27 , SCC - 25 , KB ) .
After treatment of SCC - 25 cells , p - PDK1 , p - CDC2 , CDk6 , Cyclin E , cPKC伪 expression were downregulated .
The expressions of CDK2 , CDC2 , CDK2 , cPKC伪 , ERK 1 / 2 were up - regulated in CAL - 27 cells . After the treatment of KB cells , the expression of CDK2 and CDC2 was up - regulated . After treatment of KB cells , the expression of p - ERK , p - CDC2 , CDK2 , cPKC伪 and / 2 / 2 was up - regulated . After the treatment of cells with GTE and egcg , it was also observed that some tumor suppressor genes were downregulated ( e.g . p53 , RB , PTEN ) . GTE plays an important role in inhibiting tumor growth . GTE plays an important role in inhibiting tumor growth . GTE plays an important role in tumor growth . GTE has a better antitumor effect than a single component of green tea , such as egcg .

In the third experiment , GTE and GTE - sensitive cells CAL - 27 were implanted subcutaneously in nude mice . Through in vivo experiments , we found that GTE and egcg had a significant inhibitory effect on the growth of transplanted tumors ( P0.01 ) .

Conclusion :

GTE and egcg inhibited the growth of human oral squamous cell carcinoma ( SCC - 27 ) , SCC - 25 ( SCC - 25 ) and KB cells .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.8

【参考文献】