CPTⅡF352C突变对于重症EV71感染的临床和机制研究

发布时间：2018-04-29 15:12

  本文选题：肠道病毒71型 + 肉碱棕榈酰基转移酶II　； 参考：《青岛大学》2016年博士论文

【摘要】：第一部分CPT II F352C突变对重症EV71感染的临床研究目的研究肉碱棕榈酰基转移酶II(CPT II)基因多态性与EV71感染遗传易感性的关系,探讨CPT II F352C突变及低血ATP水平对重症EV71感染的影响。方法于2009年05月至2013年11月收集山东青岛地区的EV71感染患儿333例,根据病情轻重分成EV71感染组、EV71脑炎组。提取患儿外周血白细胞的基因组DNA,应用聚合酶链反应扩增EV71感染患儿及328例正常对照儿童CPT II的5个外显子,并利用haploview软件识别该基因的所有单倍型,分析各个位点间的连锁不平衡关系;同时检测患者外周血ATP水平,记录患儿的症状、体征、临床特点及实验室检测指标。结果EV71感染组患儿CPT II F352C位点G等位基因频率明显高于正常对照组(26.9%VS20.4%,OR=1.432,95%CI=1.109-1.713,p=0.006),且该位点G等位基因频率在EV71脑炎组与普通手足口病组相比,其差异也有明显的统计学意义(36.3%VS24.7%,OR=1.734,95%CI=1.145-2.626,P=0.009)。V368I位点基因频率、等位基因分布在EV71感染组与对照组中无显著统计学差异(P0.05),但在EV71感染患儿中,EV71脑炎患儿V368I位点A等位基因频率明显高于普通手足口病患儿(17.7%VS27.7%,OR=0.564,95%CI=0.343-0.927,P=0.023)。CPT II F352C位点(TG+GG)基因型携带患儿ATP水平在重症组(0.63±0.06 mmol/L vs.0.69±0.08 mmol/L,P0.01)和轻症组(0.93±0.08 mmol/L vs.0.96±0.05mmol/L,P=0.025)中均有明显下降,而且在EV71脑炎患儿中,A-G单倍型携带患儿其ATP水平较A-T单倍型(0.65±0.09mmol/L vs.0.69±0.07 mmol/L,P0.01)及G-T单倍型(0.65±0.09 mmol/L vs.0.69±0.05 mmol/L,P0.01)均有明显下降;A-G单体型患儿ATP水平与持续发热时间、CRP水平、白细胞计数及血糖浓度均呈显著的负相关(P0.01,P0.01,P0.05,P0.01),而与病毒载量没有明显的相关关系(P0.05)。结论1.CPT II F352C突变与重症EV71感染有关,G等位基因携带者EV71脑炎的发病几率明显升高。2.CPT II A-G单倍型携带者与重症EV71感染有关。3.CPT II F352C位点G等位基因携带者EV71感染后ATP产生减少,导致了线粒体能量代谢障碍,从而介导EV71感染重症的发生发展。第二部分CPTII F352C突变对CPTII蛋白功能的影响目的研究EV71感染及不同温度干预转染细胞后CPTⅡ酶活性、脂肪酸β-氧化和ATP水平、线粒体膜电位,最终明确1055TG/F352C突变对重症EV71脑炎患者CPTⅡ功能的影响。方法随机选取3例EV71重症脑炎患儿:经CPTⅡ基因全外显子测序,证实为CPTⅡ1055/F352C位点野生型(TT)1例及CPTⅡ1055/F352C位点变异型2(TG/GG各1例)例。扩增制备含有CPTII F352C基因的片段,并与载体GV416进行重组,实现体外环化,获得含有CPTII F352C野生型和突变型基因的过表达慢病毒载体并共同转染Vero细胞,各组分为2部分,分别加入EV71悬液和等量DMEM培养液,培养72小时后,分别置于37℃、39℃和41℃情况下培养2小时,并立即利用不同浓度的L-Carnitine作为底物,测定CPTⅡ剩余酶的活性;同时经荧光探针JC-1染色,以流式细胞仪检测数据经Cell Quest软件采集,以二通道(FL2)与一通道(FL1)平均荧光强度的比值(FL2/FLl)检测线粒体膜电位;用1%的三氯乙酸处理Vero细胞后,收集上清液,经luminometer检测相对光单位,根据标准曲线计算ATP的浓度。结果CPTⅡ1055TG/F352C位点GT、GG基因型携带者未经EV71干预时,于41℃培养2小时后,其线粒体膜电位较37℃、39℃条件下明显下降;而感染EV71后,线粒体膜电位在各培养温度下均有明显下降,且与温度呈明显的负相关;同时GT、GG基因型Vero细胞经EV71干预后,其ATP水平较前下降,且在39℃、41℃培养温度下,其ATP水平较37℃培养条件下有显著下降,与培养温度之间存在明显的负相关,TT基因型患者感染EV71后ATP水平无明显差异;该位点G等位基因携带者感染EV71后CPTⅡ剩余酶活性较未干预时明显降低,且随温度升高,呈热不稳定性,温度越高,CPTⅡ剩余酶活性越低。结论1.CPT II F352C突变导致EV71感染后细胞线粒体膜电位下降,线粒体功能性损伤,继而引起ATP产生不足。2.CPT II F352C突变体感染EV71后CPTⅡ酶活性下降,高热加重CPT II功能缺陷,引起一系列代谢紊乱,影响ATP的产生。
[Abstract]:The results showed that the frequency of G allele of CPT II F352C was significantly higher in EV71 infection group than in the normal control group ( 26 . 9 % vs 20 . 4 % , OR = 1.432 , 95 % CI = 1.109 - 1.713 , p = 0.006 ) , and the frequency of G allele was significantly higher in EV71 infection group than in normal control group ( 36.3 % VS20.7 % , OR = 1.734 , 95 % CI = 1.145 - 2.626 , P = 0 . 009 ) . There was no significant difference between EV71 infection group and control group ( P0.05 ) . But in EV71 infected children , the allele frequency of V368I locus in EV71 encephalitis was significantly higher than that in children with common hand - foot disease ( 17.7 % VS21.7 % , OR = 0.564 , 95 % CI = 0.343 - 0.927 , P = 0.023 ) . The effect of the mutation of CPTII F352C on the function of CPTII protein was studied . The activity of the residual enzyme of CPT 鈪，

本文编号：1820469