肠道病毒71型与宿主干扰素系统相互作用的机制研究

发布时间：2018-05-14 12:58

  本文选题：肠道病毒71型 + 人肠道上皮细胞　； 参考：《南京大学》2016年博士论文

【摘要】：肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)是单股正链RNA病毒,是引起婴幼儿手足口病的主要病原体。从1969年在美国Califonia分离出来至今,EV71在全世界已有很多次爆发流行,但大规模流行主要集中在亚太地区。大部分病例为自限性疾病,常表现为手足口部位的疱疹,重症患儿常伴有脑膜脑炎、脊髓灰质炎样急性迟缓性麻痹、脑干脑炎等神经系统的并发症,部分患者因肺出血、肺水肿而死亡。至今为止,临床上还没有有效的抗病毒药物,对EV71感染的患者目前主要以对症和支持治疗为主。干扰素(Interferon, IFN)是天然免疫的第一道防线,通过诱导无数抗病毒蛋白(interferon-stimulated genes, ISGs)的产生,发挥其抗病毒作用。由于IFN的抗病毒作用的影响,病毒逐渐进化出各种抵抗IFN的抗病毒作用的机制。一般来说,病毒是通过抑制干扰素的产生或阻断干扰素的反应来拮抗干扰素的抗病毒作用。近年来的研究发现,EV71不仅可以抑制IFN的产生,并且能够抑制外源性IFN的作用。但具体机制尚不清楚,需要进一步研究。人肠道上皮是EV71的起始复制点,但EV71感染的患儿却少有肠道症状,提示在肠道存在特异性的免疫反应。但这方面研究缺乏相关报道。我们前期研究结果显示,EV71感染人横纹肌肉瘤细胞(Rhabdomyosarcoma cell,RD)及人宫颈癌上皮细胞(Human cervical carcinoma cell line, HeLa)后,宿主细胞只能产生极低水平的IFN-p,而EV71感染肠道细胞(Human colorectal adenocarcinoma HT-29)后,能诱导大量的IFN-β的产生。不同细胞对EV71反应的差异的具体机制不清,需进一步研究。本研究应用real-time PCR的方法检测感染EV71的RD. HeLa和HT-29细胞中各种IFNs的表达。结果显示,与RD和HeLa细胞相比,在EV71感染的HT-29细胞中,不仅IFN-p,其他Ⅰ型IFN (IFN-α、-ε、-κ和-ε)、Ⅱ型IFN (IFN-γ)以及Ⅲ型IFN (IFN-λ1、-λ2和-λ3)的表达都明显的升高。IFN的产生主要由RLR和TLR这两条信号通路介导。通过应用免疫印迹的方法对比这两条信号通路的主要蛋白的表达情况,我们观察到,一方面,在RD、HeLa和HT-29细胞中,EV71感染明显下调RIG-I样受体(retinoic-acid-inducible gene I-like receptors, RLR)信号通路的重要信号分子线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS),说明三种细胞中,RLR信号通路都受到明显抑制,区别不大；而另一方面,在RD和HeLa细胞中,EV71感染显著地诱导Toll样受体信号通路的重要信号分子p干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-p, TRIF)的降解,而在HT-29细胞中TRIF并没有被EV71降解。我们进一步研究TRIF在RD或HeLa细胞被降解的原因,免疫荧光和免疫印迹的实验结果显示,过表达3C能够切割RD细胞中TRIF蛋白,但对HT-29细胞中的TRIF蛋白的表达没有影响。应用慢病毒系统构建敲低TRIF基因的HT-29细胞,然后用EV71感染敲低TRIF的HT-29细胞和正常表达TRIF的HT-29细胞,观察其宿主抗病毒反应。结果显示,与正常表达TRIF的HT-29细胞相比,EV71明显抑制敲除TRIF的HT-29细胞的IFN的产生。收集细胞上清,应用TCID50的方法检测病毒滴度。实验结果显示,敲除TRIF的HT-29细胞上清中的病毒滴度明显高于正常表达TRIF的HT-29细胞上清的病毒滴度。以上结果说明EV71主要通过TLR-TRIF信号通路诱导HT-29细胞产生IFN,从而抑制病毒感染,而这一通路在肠道上皮细胞没有被完全抑制。本研究揭示了EV71在肠道细胞中能够诱导特殊的抗病毒宿主免疫反应的机制,不同于在RD或HeLa细胞,可能是感染后肠道症状轻微的原因之一。干扰素通过JAK-STAT信号通路发挥抗病毒作用。我们针对EV71感染与JAK-STAT信号通路的相互作用过程进行了研究。尽管几十年来,IFN作为一种有效的抗病毒药物用于临床治疗各种病毒感染,如人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒和乙肝病毒,但是对EV71感染的患儿并没有明显效果。EV71可能通过某种机制抑制外源性IFN的作用。然而目前关于EV71抑制IFN作用的机制仍存在争议。有部分学者认为,EV71的2A蛋白通过诱导干扰素的受体(IFN-Alpha/Beta Receptor 1, IFNAR1)的降解,抑制IFN的信号传导。而另有部分学者的研究表明,EV71感染对IFNAR1的蛋白水平并没有影响,而是通过降低Janus激酶1(Janus kinase 1, JAK1)的蛋白水平,抑制JAK-STAT信号通路,从而阻断IFN的作用。本研究中,我们通过在IFN预处理过的细胞感染EV71病毒,采用结晶紫染色法和TCID50的实验结果显示,用IFN预处理细胞既不能抑制EV71感染造成的细胞病变效应,也不能抑制病毒的复制和释放。另外,免疫印迹的实验结果显示,大剂量的EV71感染,对IFNAR1、JAK1和信号传导及转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription 1/2, STAT1/STAT2)的蛋白水平均没有明显的影响。结果因而提示,EV71感染对于干扰素的不敏感可能通过其它机制介导。进一步通过核浆分离实验和免疫荧光实验我们发现,EV71感染并不抑制IFN诱导的STAT1/2的磷酸化,但是却阻断了p-STAT1/2的核转位。采用免疫共沉淀实验我们发现,EV71能够抑制核转运蛋白A1(karyopherin α1, KPNA1)和STAT1的相互作用；而KPNA1作为核定位信号蛋白,参与蛋白的核质转移过程,其对于p-STAT1的入核是必不可少的。提取EV71感染的蛋白,用免疫印迹的方法检测KPNA1蛋白的表达,我们发现EV71感染可以诱导KPNA1蛋白的降解。蛋白质的降解可通过病毒蛋白酶的水解作用,或是由细胞内的蛋白降解途径介导。而细胞内蛋白的降解途径主要有三个：1)泛素蛋白酶体途径；2)自噬溶酶体途径；3)胱天蛋白酶(caspase)介导的蛋白降解途径。体外过表达EV712A和3C蛋白并不能酶解KPNA1,说明KPNA1的降解和病毒蛋白的蛋白酶活性无关。应用caspase光谱抑制剂、自噬抑制剂以及溶酶体抑制剂处理细胞,发现只有在应用caspase广谱抑制剂的情况下,才能够逆转EV71感染对PNA1的下调作用。进一步应用caspase-3、caspase-4、caspase-6和caspase-8的特异性抑制剂前处理细胞。结果表明,只有在应用caspase-3特异性抑制剂的前提下,才能够逆转EV71对KPNA1的降解作用,说明EV71诱导的KPNA1的降解是由caspase-3介导的。此外,萤火虫荧光素酶实验和realtime PCR的结果显示,过表达2A和3C蛋白既不影响ISRE的活性,也不影响IFN诱导的ISGs的产生。另外,通过免疫荧光实验和核质分离实验我们观察到,EV71感染抑制IFN诱导的干扰素调节因子9(interferon regulatory factor, IRF9)的核转位以及STAT2和IRF9蛋白的表达,但不影响STAT1的表达；应用转染的方法同时过表达STAT2和IRF9,也能够逆转EV71对IFN诱导的ISGs的抑制作用。综上所述,本研究首先阐明了EV71感染,在肠道HT-29细胞中抗病毒天然免疫得以诱导的机制,即通过TLR/TRIF信号通路介导HT-29细胞产生IFN,而这一机制在RD和HeLa细胞中由于TRIF被降解而被有效抑制。本研究还试图阐明EV71抑制IFN作用的新机制：EV71一方面通过活化caspase-3诱导KPNA1的降解,从而抑制p-STATl的核转位,阻断IFN诱导的ISGs的产生；另一方面可以通过抑制IFN诱导的STAT2和IRF9的表达,从而抑制ISGs的持续高表达。以上研究结果将加深我们对EV71感染的致病机制和宿主防御机制的认识和理解,也为今后抗EV71病毒药物的研发奠定了理论基础。
[Abstract]:Enterovirus 71 ( EV71 ) is a single strand of positive strand RNA virus , which is the main pathogen of infantile hand - foot disease . In recent years , EV71 has been mainly concentrated in the Asia - Pacific region . Compared with RD and HeLa cells , the expression of IFN - p , IFN - 伪 , IFN - 纬 , IFN - 纬 and IFN - 位1 , - 位2 and - 位3 in HeLa and HT - 29 cells were significantly increased .
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本文编号：1887943