MicroRNAs在病毒性心肌炎发病中调控作用的初步研究和新型柯萨奇病毒CVB3减毒株的构建与筛选

发布时间：2018-05-24 10:37

本文选题：CVB3 + 病毒性心肌炎　；参考：《北京协和医学院》2012年博士论文

【摘要】：柯萨奇病毒的B组(CVB)是侵犯人类心肌引起病毒性心肌炎的首位病原体,其中尤其3型(CVB3)最常见。病毒性心肌炎在儿科临床是常见的一种传染病,而成人散发。感染后可出现发热,发病后可引起突然的、急性心力衰竭,死亡率高。病毒性心肌炎可发展为扩张性心肌病。CVB3导致病毒性心肌炎的发病机制主要由病毒直接作用与病毒感染后引起机体高免疫炎症性反应所致。关于病毒性心肌炎,目前临床缺乏有效的预防手段与特异的治疗药物。因此对CVB3感染的预防与治疗研究都亟待必行。因而有必要对CVB3的病原学与CVB3的致病机制进行深入研究,为开发有效的预防与治疗药物提供科学依据。因此我们进行了如下两部分工作。第一部分：初步分析特异性microRNAs(miRNAs)在CVB3病毒性心肌炎发病中的变化和对免疫炎性反应可能的调控作用。目的：利用小鼠病毒性心肌炎动物模型,来评估miRNAs在病毒性心肌炎发病机制中的作用。方法：用表达谱芯片分别检测病毒组与对照组小鼠心脏组织microRNA与mRNA的差异表达。使用实时RT-PCR对差异表达的基因进行验证。用miRBase、miRanda与TargetScan3个数据库预测差异表达的microRNA靶基因并取交集。使用Gene Ontology(GO)与Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes (KEGG)软件检测靶基因的功能与生物学通路,分析miRNAs的调控作用。结果：有64个microRNAs出现变化,其中5个microRNAs有生物学统计意义(p0.05)。分别是miR-146a、miR-23a、miR-21、 miR-374、miR-29a*。这5个差异表达的microRNAs参与调节体内重要的免疫学通路,如Toll-样受体(TLR)信号通路、RIG-I样受体(RLR)信号通路、细胞因子与受体相互作用通路、MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路,并且经实时RT-PCR实验验证了这些通路的某些信号蛋白是差异表达的miRNAs的靶基因。结论：在CVB3病毒性心肌炎的发病机制中,病毒感染后,多个与免疫调节通路相关的特异性miRNAs产生变化,并同时与心肌炎发病有关的炎症因子的变化相关。这个研究有助于深入理解病毒性心肌炎的发病机理,为开发抗CVB3感染与病毒性心肌炎治疗药物提供了新的视角。第二部分：探索柯萨奇病毒非编码区外源microRNA插入的稳定性。目的：利用pCMV5/CVB3感染性克隆质粒,在其CVB3序列两侧的5’端与3’端非编码区分别插入心肌组织特异的内源性microRNAs的互补序列,构建含miRNAs互补序列的重组CVB3病毒,观察其复制的稳定性,为新型CVB3分子减毒疫苗株的研究奠定基础。方法：利用分子克隆技术和microRNA的操作技术,将合成单一和三串联的miRNAs经退火制备成双链miRNAs,分别在CVB3序列的5'UTR和3'UTR选点插入。用重组病毒质粒转染Hela细胞,观察其能否恢复为完整的病毒颗粒,将重组病毒感染TE671细胞,并提取病毒RNA进行测序鉴定。结果：5’端插入构建的重组病毒质粒经测序确定后,将其转染不含内源性miR-133的Hela细胞后能够转录出完整的病毒颗粒,细胞产生明显病变,并且用RT-PCR及WesternBlot鉴定为完整病毒颗粒。感染含有内源性miR-133的TE671细胞不出现病变,证明内源性miR-133识别重组CVB3序列中的miR-133互补链并产生对CVB3复制及翻译抑制作用。当在Hela细胞连续传3代后,再用重组病毒感染含有miR-133序列的TE671细胞也出现病变,提取重组病毒RNA测序发现miR-133序列被切除,相邻的病毒序列没有发生改变。做重复实验得到同样的结果。因此我们继续在3’端寻找构建点,经多步克隆完成构建,重组病毒质粒转染Hela细胞后能够转录出完整的病毒颗粒,复制良好。目前正在用重组病毒感染含有miR-133的TE671细胞并观察,同时进行多次传代观察其插入稳定性。结论：在CVB3基因组5'UTR的BstBI位点插入外源miR-133互补序列后,由于5'UTR功能区较多,影响了病毒的复制,并导致病毒基因组出现不稳定,经多次传代后易发生病毒回复的情况。病毒在复制过程中把外源序列切除的目的是保证其基因组在进化上的稳定性。因此认为在构建重组CVB3病毒时,避开5'UTR该位点区。目前观察到3'UTR区插入外源序列无论从理论上和实际的结果上还是存在可行性的。
[Abstract]:CVB3 is the first pathogen of viral myocarditis caused by human cardiac muscle , especially type 3 ( CVB3 ) . It is common in pediatric clinic . Viral myocarditis can develop into dilated cardiomyopathy . The pathogenesis of viral myocarditis can be caused by viral myocarditis . It is necessary to study the pathogenesis of CVB3 . Therefore , it is necessary to study the pathogenesis of CVB3 and provide scientific basis for the development of effective prevention and treatment . Therefore , we have done the following two parts .

Objective : To investigate the role of microRNAs in the pathogenesis of viral myocarditis by using gene Ontology ( GO ) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes ( KEGGS ) .

A recombinant CVB3 virus containing miR - 133 was transfected into Hela cells .
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R725.1

【参考文献】