先天性肛门直肠畸形发病的基因网络调控机制研究

发布时间：2018-05-29 06:22

  本文选题：mRNA + miRNA　； 参考：《重庆医科大学》2016年博士论文

【摘要】：第一部分miRNA-mRNA芯片联合筛选肛门直肠畸形的致病基因目的:检测肛门直肠畸形(Anorectal Malformations,ARMs)患者直肠末端组织中的miRNA表达谱、mRNA表达谱,利用生物信息学方法对结果进行分析,初步探讨肛门直肠畸形的发生发展的基因网络调控机制。方法:选取我院2013年5月至10月诊断为ARMs的患儿直肠盲端组织标本7例作为实验组,其中男5例,女2例,中高位闭锁4例,低位3例,另取3例尸检婴儿(死于非肠道疾病)直肠末端标本作正常对照。Trizol法提取总RNA并检测质量,运用miRNA、mRNA芯片进行分别检测,筛选三组差异表达的miRNA、mRNA,对差异基因及miRNA做趋势分析,筛选得到显著性的基因表达趋势,对差异miRNA进行靶基因预测,并与筛选得到的差异基因取交集,得到交集基因1,对交集基因1进行Gene Ontology基因功能及生物学通路富集分析,利用Cytoscape软件整合KEGG、HPRD、BIOGRID、INTACT、MINT等数据库对显著性差异的GO及Pathway条目下的所包含的基因进行相互作用分析,找出其中的关键调控基因。选取其中4个采用实时定量PCR验证,运用单因素方差分析对结果进行比较。结果:通过将对照组、低位组、高位组数据进行比较,筛选出8011个差异基因及88个差异micro RNA。mRNA显著性趋势有4个,miRNA显著性趋势有2个,miRNA靶基因预测后与mRNA取负交集共得到差异基因2705个。对差异基因进行GO富集分析,显著性差异的GO条目为转录及转录调控、信号转导、凋亡过程、胚胎形成、神经系统发育、肌细胞分化等;对KEGG信号通路分析发现差异基因主要位于肿瘤相关信号通路、神经营养因子信号通路、EB病毒感染、细胞骨架调控、钙离子信号传导、肿瘤调控等通路。将显著差异GO及Pathway条目下的基因进行基因、基因产物相互作用分析,得到的Signal-Net网络分析其中的核心基因,包括MAPK1、FGFR2、EP300、SRC、PLCB1、CDC42、MLLT4、TJP1等,根据micro RNA和靶基因之间调控关系,构建micro RNA-Gene-Network,关键micro RNA包括has-miR-124-3p、has-miR-29c-3p、has-miR-1185-2-3p、has-miR-103a-3p、has-miR-4795-3p等,选取基因MAPK1、FGFR2、EP300进行Real-Time PCR验证,均具有显著性差异(P0.05)。结论:运用miRNA-mRNA芯片结合生物信息学工具对ARMs发生相关的差异基因进行深入分析,最终筛选到与该病发病相关的关键基因,证明基因网络在肛门直肠畸形的的发生发展中起到重要的调控作用,筛选的差异基因可能成为今后研究ARMs的新方向。第二部分维生素A及其相关基因在肛门直肠畸形发病中的作用研究目的:检测血清维生素A水平、组织中维生素A相关受体表达水平、与维生素A相关的新基因HA117及其相邻的DPF3基因表达水平与先天性肛门直肠畸形患儿发病的关系,探讨维生素A在肛门直肠畸形发病中的作用。方法:1、随机选取重庆医科大学附属儿童医院胃肠、新生儿外科2012年5月至2013年9月诊断为ARMs的患儿35例,其中男22例,女13例,年龄1天—8月23天,其中低位闭锁11例,中位闭锁12例,高位闭锁12例,收集术后切除患儿直肠盲端组织作为实验组;另取7例尸检婴儿(死于非肠道疾病)直肠末端组织标本作为对照组。Trizol法提取总RNA,采用实时荧光定量PCR方法分别检测实验组与对照组组织标本中的HA117、DPF3b、RARα、RARβ、RARγ的表达量,提取组织蛋白,运用western-blot方法检测实验组与对照组组织标本中DPF3b、RARα、RARβ蛋白表达水平2、第一次入院时抽取35例患儿静脉血2ml,收集上清;另收集10例正常新生儿血清作为对照组,采用高相液相色谱法对两组血清标本vit A水平进行检测3、采用SPSS19.0软件对数据进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析,以P0.05为差异有统计学意义。结果:1、Q-PCR结果显示,肛门直肠畸形患儿直肠盲端组织中RARα表达量较对照组明显降低(P0.01),RARα表达量随盲端位置升高而表达降低;RARβ在中高位、低位ARMs与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05);RARγ在ARMs各类型组织中表达与对照组未见明显差异(P0.05),HA117表达量中高位组、低位组较对照组均有明显差异(P0.01),三组表达量依次下降;DPF3b与HA117相反,三组表达依次增高;2、western-blot检测DPF3b、RARα、RARβ蛋白表达水平,DPF3b在对照组、低位组、中高位组依次降低,组间比较有统计学差异(P0.01);RARα在中高位组表达明显下降,低位组表达较对照组也降低(P0.05);RARβ在中高位组、低位组表达与对照组无明显差异;3、实验组中高位、低位患儿血清维生素A水平较对照组明显降低(P0.01),分别为0.37±0.11,0.38±0.14,0.90±0.09μmol/L,按病理类型分组,中高、低位ARMs组间患儿血清Vit A水平未见明显差异(P0.05)。结论:维生素A及其受体在胚胎期肠道发育中至关重要,维生素A缺乏可能是引起肛门直肠畸形发病原因之一。新发现的维生素A相关基因HA117可能通过与DPF3负调控参与了其发病过程。第三部分以慢病毒为载体跨胎盘RNAi RARα基因构建肠道畸形小鼠的实验研究目的:应用慢病毒载体,采用跨胎盘RNA干扰技术干扰胚胎鼠RARα基因表达,实验探索基因部分下调小鼠的高效技术,并观察干扰RARα基因后的小鼠肠道发育情况。方法:构建维生素A特异性受体基因RARα干扰慢病毒,将重组干扰慢病毒转染小鼠胚胎来源的间充质干细胞C3H10T1/2,通过RT-PCR、Western-blot方法验证其对RARα基因的干扰效果;通过尾静脉向孕期9天时母鼠分别注射RARα-RNAi慢病毒载体、空载病毒载体及Ringer’s液。注射96小时后处死部分孕鼠,取出胚胎观测胚胎变化,体视荧光仪检测胚胎荧光表达情况,并采用Western blotting及RT PCR检测RARα、Sonic hedgehog(Shh)、HA117的表达情况;剩余孕鼠自然分娩后观察子代鼠肠道发育情况,采用适当指标对肠道发育情况进行评价。结果:1)RARα-RNAi慢病毒载体及LV-vector空病毒可以成功感染C3H10T1/2,干扰有效;2)动物实验中,尾静脉注射病毒96小时后体式荧光可以检测到荧光,注射108Tu/只病毒量较其他注射量明显(P0.05);3)RARα-RNAi组胚胎RARα基因mRNA及蛋白表达较空载组、Ringer’s对照组明显下调(P0.01);4)Ringer’s组、空载对照组胚胎及新生鼠中未见明显发育异常,RARα-RNAi胚胎及新生鼠中发现肛门闭锁、四肢及脊柱发育异常、头面部发育异常等畸形鼠;5)RARα-RNAi组小鼠肠道组织与其他组比较,发育迟缓,肌层较薄,神经节细胞发育不良,RARα、Shh、HA117表达水平低(P0.01)。结论:采用慢病毒作为载体实现跨胎盘RNA干扰,方法可行、干扰有效,可实现干扰动物体内基因部分表达的效果,构建基因下调模型动物;RARα基因在胚胎发育中起到重要作用,部分干扰RARα基因可导致小鼠肠道发育畸形及其他畸形,其机制可能是通过RARα/Shh信号通路实现。第四部分采用二代测序技术探讨相关基因在ARMs发生中的作用目的:采用第二代测序技术探讨基因RARα、RARβ、HA117、DPF3、MAPK1、FOXO3、Shh、EP300、FGFR2在肛门直肠畸形中的作用,对这些基因进行突变筛查。方法:收集我院50例2013年5月至2014年12月诊断为ARMs患儿血液标本,提取外周血全基因组DNA,设计针对RARα、RARβ、HA117、DPF3、MAPK1、FOXO3、Shh、EP300、FGFR2外显子区域的特异性探针,利用多重PCR扩增的方法对引物进行多重扩增,并采用Hiseq2500进行测序,使用SOAPsnp及GATK软件分析样本SNP及突变信息,通过数据库比对及分析,确定突变位点。结果:设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地富集基因组DNA的外显子区域。在50个样本中共发现31个突变位点,其中错义突变15个,无义突变16个。与亚洲人这些突变位点发生率进行比对,有10个差别较大的位点,其中7个为错义突变,且全部位于Fox O3基因上。7个位点中的3个为新发现突变,分别为c1582 T(29)G、c 874 C(29)T、c1088 T(29)A,有5个可以导致氨基酸疏水性改变,包括rs199833934/rs9635679、rs201947198/rs9635700、c 1241 T(29)A、c1088T(29)A、c 874 C(29)T。结论:多重扩增测序技术能够发掘ARMs发病相关的新突变,该方法快速有效。Fox O3上的突变位点可能与ARMs的发病密切相关,Fox O3可以作为研究ARMs的新方向。
[Abstract]:In order to find out the key regulatory genes involved in the diagnosis of anorectal malformation ( ARMs ) , we screened out 8011 differential genes and 88 differentially expressed micro RNAs by using the method of bioinformatics . The effects of vitamin A and its related genes on the pathogenesis of anorectal malformation were studied . The expression levels of RAR伪and RAR伪were significantly lower than those in the control group ( P0.05 ) . The results showed that the expression of RAR伪was significantly lower than that in the control group ( P0.05 ) . 3,瀹為獙缁勪腑楂樹綅,浣庝綅鎮ｅ効琛，

本文编号：1949828