Omega-3多不饱和脂肪酸对人肝细胞和巨噬细胞抗炎作用的实验研究

发布时间：2018-06-10 14:46

本文选题：omega-3多不饱和脂肪酸 + omega-6多不饱和脂肪酸　；参考：《山东大学》2012年博士论文

【摘要】：研究背景及目的危重新生儿、早产儿、先天性消化道畸形、严重消化道疾病以及消化道手术的患儿不能通过胃肠道获得足够营养时,需要用静脉营养液由静脉途径提供各种营养素,称为静脉营养,又名完全胃肠外营养(total parenteral nutrition,TPN)。静脉营养,已被儿科界尤其是新生儿界普遍公认为是一种相对安全、有效的治疗措施,能及时为患儿提供必要的能量、营养,维持患儿的生命,为进一步治疗赢得时间。但是,随着TPN在儿科领域临床应用范围的扩大,其并发症也日见增多,尤其是长期应用的患儿更容易发生。早在1971年,Peden V. H就报道了胃肠外营养相关肝损害(parental nutrition associated liver disease,PNALD),并指出PNALD是TPN常见的严重并发症,甚至可威胁患儿生命；并且随着TPN应用时间的延长,其发生率也相应增高。尤其对于那些生理机能尚未发育成熟的新生儿和婴幼儿,在长期接受TPN治疗时,更容易发生PNALD。1998年,Kelly的研究报道显示,长期接受TPN治疗的患儿中,大约有40%-60%的患儿会发展成不同程度的肝功能紊乱。同年,Sondheimer等做了一项临床研究,在42名接受六周短期TPN治疗的患儿中,约有13%的患儿发展成为肝功能衰竭。PNALD在成人和婴幼儿中的病理基础是不同的,成人以肝脂肪变性为主,而婴幼儿则以胆汁淤积最为常见。进展型PNALD可以导致肝脏损害,肝衰竭,甚至多脏器功能衰竭,一旦发生PNALD,不仅需要中断TPN的治疗,还会对原发病产生不良影响,严重者甚至危及生命。因此,PNALD的预防与治疗显得尤为重要。目前,PNALD发病的确切机制尚不清楚,但TPN相关胆汁淤积(TPN-associated cholcstasis, PNAC)是其主要的病理基础。PNAC的发生普遍认为是多因素共同作用的结果,诸如早产儿肝脏功能不成熟、早期禁食、胃肠外营养液中营养成分失衡以及某些成分具有肝毒性、胎龄以及早期感染(如败血症、导管相关性感染、坏死性小肠结肠炎)及肠道手术等基础疾病。第一、PNAC与早产儿及新生儿尚未发育成熟的胆汁排泄系统和肝脏功能密切相关,首先,发育不成熟的胆管系统使得肝脏的摄取率降低,胆汁酸再循环障碍；其次,由于早产儿的肝脏转运和胆酸代谢功能均不完善,肝脏摄取、合成胆盐的能力降低导致胆红素的肝肠循环障碍；再次,由于胆汁在肠道内停留时间延长,在肠道细菌作用下的石胆酸形成(毒性胆盐)增多,并重吸收到肝脏,对肝细胞产生毒性作用。第二,接受TPN治疗的患儿由于不能耐受经口喂养,或喂养不足,喂养延迟,缺乏有效的胃肠道刺激,使一些胃肠激素,如胃动素、胃泌素、促胰液素、胰高血糖素、舒血管肠肽等减少,胆囊收缩力下降,导致胆汁淤积。有研究表明,早期肠内喂养的平均摄入量与胆汁淤积的发生率呈负相关。第三,不恰当的TPN及营养成分失衡,首先,例如：高热卡,静脉营养液的热卡过高使肝脏内水分、糖原和脂肪沉积增加,从而引起肝细胞肿胀,胆管堵塞,最终导致胆汁淤积。有研究显示,随着摄入热卡的降低,PNAC的发生率明显下降；其次,必需氨基酸的缺乏,输入氨基酸的量和成分亦与PNAC的发生有关。TPN溶液的肝毒性可能与酪氨酸、半胱氨酸、牛磺酸等必需氨基酸缺乏有关。牛磺酸对早产儿是一种重要的氨基酸,它与多种肝酶的活性有关,可促进胆汁流动和防止石胆酸的毒性,缺乏牛磺酸可引起胆汁淤积。第四,感染,接受静脉营养的患儿发生感染后随之出现了胆汁淤积,原因可能为细菌等病原微生物感染后导致肝酶异常,胆汁分泌减少,致病微生物产生的内毒素抑制了肝细胞膜Na+-K+-ATP酶的活性,肝胆管的转运系统受到破坏、功能失调,从而抑制了肝细胞对胆汁酸的摄取及转运。内毒素的刺激,使肝脏发生了一系列炎症级联反应,首先,肝脏Kupffer细胞产生肝毒性的细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6；其次,肠道也作出了相应反应,即正向调节细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的产生,加重了肝脏的损伤。小肠蠕动的减慢和肠内细菌过度滋生,内毒素产生增加,而内毒素可以直接损害肝细胞,减少胆汁的合成及分泌,加重胆汁淤积的程度。反之,胆汁淤积导致胃肠道感染,严重感染促进胃肠道脓毒症的发生,随之而来的是全身系统性炎症反应,产生了大量细胞因子,直接抑制了肝细胞转运蛋白和酶的活性,进而又促进肝脏的纤维化,加重了原有的胆汁淤积,这样就形成了感染和胆汁淤积之间的恶性循环,进一步导致严重的PNALD。近年来,研究最多的是静脉营养乳化脂类在PNALD的发生、发展过程中所起的重要作用。临床上应用的脂肪乳剂主要成分为脂肪酸和甘油三酯,其中的脂肪酸有多种,根据脂肪酸分子结构中碳链的长度可分为短链脂肪酸(2C-4C)、中链脂肪酸(6C-12C)和长链脂肪酸(14C-24C)。由于人体不能合成亚油酸、亚麻酸和二十碳四烯酸,这三种脂肪酸必须从外界摄取,因此称之为必需脂肪酸,其它脂肪酸称为非必需脂肪酸；脂肪酸碳链中的碳原子间有的完全以共价键结合,称为饱和脂肪酸,有的则含有不饱和双键,称为不饱和脂肪酸,含有一个不饱和双键的称为单不饱和脂肪酸,含有多个不饱和双键的称为多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)。从碳链的甲基端开始,如第一个不饱和双键位于第三个碳原子上,则称为omega-3多不饱和脂肪酸,同样还有omega-6、omega-7和omega-9多不饱和脂肪酸。长链多不饱和脂肪酸中的omega-3PUFAs和omega-6PUFAs代谢后可产生花生四烯酸类物质,但omega-3PUFAs和omega-6PUFAs的代谢产物有所不同,前者代谢生成的产物为三烯酸环氧化物和五烯酸脂氧化物,后者代谢生成的是二烯酸环氧化物和四烯酸脂氧化物。Omega-6PUFAs的代谢产物具有强烈的促进炎症反应的作用,包括收缩血管和平滑肌,提高毛细血管通透性,促进血小板聚集,白细胞趋化作用和免疫抑制；而omega-3PUFAs代谢产物的化学结构虽然与omega-6PUFAs代谢产物类似,具有相似的生理功能,但其生理作用仅为omega-6PUFAs的1/100左右,为减轻omega-6PUFAs代谢产物对机体免疫功能和炎症反应的不利影响,可以在omega-6PUFAs当中添加适量的omega-3PUFAs,可以降低毛细血管通透性,减轻水肿,抑制过度的炎症反应,减轻或避免脂肪乳剂导致的免疫抑制,改善免疫功能。二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)是一种omega-3多不饱和脂肪酸,是十八碳亚麻酸的分解产物,最初从鱼油和母乳中发现,它存在于细胞膜磷脂脂肪酸结构中。有研究表明,EPA可以改变细胞磷脂膜的成分,影响细胞膜流动性和膜上相关信号分子、酶及受体的功能,从而改变信号转导过程,来调节炎症反应。Omega-3多不饱和脂肪酸的抗炎作用还表现在它能够减少前列腺素(prostaglandins)的合成,进而降低炎性因子的释放,最终实现减少炎症反应,减轻肝脏受损的程度。虽然,临床相关研究已经证实,在静脉营养液中添加适量omega-3多不饱和脂肪酸,对长期接受TPN治疗的患儿有明显的保护作用,但对于omega-3多不饱和脂肪酸确切的作用机制还不清楚。机体促炎和抗炎平衡的变化,反映了PNALD的状态及进展情况。在PNALD的发病过程中,促炎反应主要是通过巨噬细胞和肝脏中的Kupffer细胞介导的,它们是通过释放炎性因子来实现的,最具有代表性的是肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和白介素-6(IL-6)。血浆TNF-α和IL-6的水平与肝脏受损的严重程度正相关。如果损伤持续存在,就会产生大量的TNF-α和IL-6,炎症的持续存在最终会导致肝硬化和瘢痕组织的形成；另一方面,抗炎因子白介素-10(IL-10),在调节过度炎症反应方面有重要的作用,有助于降低机体炎症反应的程度。我们假设omega-3多不饱和脂肪酸可以作用于相关细胞,从而影响细胞促炎和抗炎因子的产生。本研究通过培养正常人外周血巨噬细胞和正常人肝细胞,观察在模拟外源性(LPS介导)和内源性(PGE2介导)炎症模型中,促炎因子TNF-3和IL-6分泌水平的改变,同时应用omega-3和omega-6多不饱和脂肪酸进行干预,证实omega-3多不饱和脂肪酸在抗炎反应中的重要作用。在omega-3多不饱和脂肪酸干预的巨噬细胞和LPS诱导的肝细胞联合培养的实验中,观察到促炎因子TNF-α、IL-6分泌水平的改变,从而进一步证实了omega-3多不饱和脂肪酸不仅对巨噬细胞和肝细胞有直接的抗炎作用,而且还可以通过激活的巨噬细胞对肝细胞发挥间接的保护作用。研究方法 1、细胞的分离与培养 (1)人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells)的分离与培养健康人新鲜全血(购自香港红十字会输血处)通过Ficoll Paque梯度分离法中分离出单核细胞。简单来说,将ACK buffer and Ficoll加入新鲜全血中,室温下静置15分钟,用PBS缓冲液稀释后,2000rpm离心25分钟。细胞分层,将中间层细胞(主要是淋巴细胞、单核细胞和血小板)转移到新的离心管中,室温1200rpm离心7分钟,小心去掉上清液。为了除去血小板,用PBS缓冲液混悬沉淀,800rpm离心7分钟,弃掉上清并重复此过程两次。然后,加入35ml RPMI1640培养液充分混匀,1200rpm离心7分钟。去上清,用50ml巨噬细胞SFM培养液充分混匀后,加入6-well细胞培养板(2mL/well),放置于培养箱中(37℃,5%CO2)7天后,单核细胞演变成巨噬细胞,备用。 (2)正常人肝细胞系(THLE-3)的准备正常人肝细胞系(THLE-3),购自American Type Culture Collection (ATCC,USA)培养在预先用纤维蛋白处理过的培养板中。按要求在专用的BEGM培养液中加入牛胶原蛋白-1(0.03mg/ml),牛血清白蛋白(0.01mg/ml),培养在细胞培养箱中(37℃,5%CO2),每2-3天换一次培养液,备用。 2、具体实验方案 (1) LPS、PGE2诱导的人巨噬细胞和肝细胞炎性因子TNF-α、IL-6的表达。在人巨噬细胞和肝细胞的培养液中分别加入LPS(0.1μg/ml)、PGE2(0.1μg/ml),继续孵育8h、16h、24h、32h分别收集各时间点的上清液。用酶联免疫吸附法(ELISA)方法,精确检测TNF-α和IL-6的含量。 (2)预先用EPA、AA及EPA+AA干预巨噬细胞和肝细胞,再给予LPS、PGE2刺激细胞,观察TNF-α和IL-6的表达。在巨噬细胞和肝细胞的培养液中加入100u M EPA、100μMAA、100μM EPA+AA的混合物(比例为1：1)培养24h后,用PBS洗两次,再加入LPS(0.1μ g/ml)、PGE2(0.1μg/ml)模拟体内外的炎症刺激,孵育24h后,收集上清液。用ELISA方法,精确检测TNF-α和IL-6含量。 (3)同时给予巨噬细胞和肝细胞刺激和保护,观察TNF-α和IL-6表达的变化。在巨噬细胞和肝细胞的培养液中同时加入诱导炎症发生LPS(0.1μ g/ml)、PGE2(0.1μ g/ml)以及干预试剂100μM EPA、100μMAA、100μM AA EPA+AA (比例为1：1),共同培养24h后,收集上清液。用ELISA方法,精确检测TNF-α和IL-6的含量。 (4)先用LPS、PGE2诱导巨噬细胞和肝细胞,再给予EPA、AA及EPA+AA进行干预,观察TNF-α和IL-6的表达。在巨噬细胞和肝细胞的培养液中分别加入LPS(0.1μ g/ml)、PGE2(0.1μ g/ml)培养24h后,用PBS洗两次,再向培养液中分别加入100μM EPA、100μM AA、100μM EPA+AA(比例为1：1)孵育24h后,收集上清液。用ELISA方法,精确检测TNF-α和IL-6的含量。 (5)用LPS诱导巨噬细胞,再给予EPA干预后,观察TNF-α、IL-6和IL-10在不同时间点的表达。在巨噬细胞的培养液中加入LPS(0.1μ g/ml),继续培养24h后,用PBS洗两次,再向培养液中加入100μM EPA,继续孵育8h、16h、24h、32h后,在各个时间点分别收集上清液。用ELISA方法,精确检测TNF-α、IL-6和IL-10含量,观察其变化。 (6)联合培养LPS诱导后经EPA干预的巨噬细胞和LPS诱导的肝细胞,观察促炎因子TNF-α和IL-6表达的变化。首先,在巨噬细胞的培养液中加入LPS(0.1μg/ml)培养24h后,用PBS洗两次,再加入100μM EPA;其次,在肝细胞的培养液中加入LPS(0.1μg/ml)培养24h；然后,将以上处理过的两种细胞联合培养24h后,收集上清液。用ELISA方法,精确检测TNF-α和IL-6的含量,观察其变化。 3、统计学分析所有统计资料均采用x±SD描述,统计分析应用方差分析(ANOVA)和Student's t-test检验。P0.05(*)认为差异有统计学意义。研究结果 1、LPS对巨噬细胞的刺激比PGE2的刺激更敏感。在0.1μg/ml LPS和0.1μg/ml PGE2的刺激下,巨噬细胞均产生大量的TNF-α和IL-6,甚至比未经处理的巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-6高出10倍以上,且在24h时,达到峰值,以后随着时间的延长,变化趋于平坦。相同的刺激作用于肝细胞,也可以观察到类似的结果,但其反应程度要远远低于巨噬细胞。用LPS和PGE2诱导细胞,模拟体内体外的炎性刺激,成功的诱导出细胞的炎症反应,但不同的细胞对不同的炎症刺激的反应程度是不同的。我们观察到,在24h时,反应最为显著。因此,在接下来的实验中,我们以24h作为研究的时间点。 2、在致炎因素刺激之前,对巨噬细胞和肝细胞均分别给予100μM EPA、100μMAA、100μM EPA+AA(比例为1：1)三种方式干预24h,再用0.1μg/ml LPS和0.1μg/ml PGE2刺激24h,检测TNF-α, IL-6的水平。发现相对于未干预组,EPA干预组TNF-α, IL-6的表达水平明显下降(p0.05)。AA组和EPA+AA的混合物组也观察到了TNF-α、IL-6不同程度的下降,但其下降幅度远不如单独EPA干预组(p0.05)。 3、当同时给予巨噬细胞和肝细胞刺激因素0.1μ/ml LPS、0.1μg/ml PGE2以及三种不同的干预方式进行保护时,我们可以清楚的观察到,虽然在各个干预组中TNF-α和IL-6的表达都有所下降,但只有EPA干预组变化最为显著。比较两种不同时间的干预(先给予干预还是同时给予刺激和干预),可以得出：先给予干预的效果要好于后者。 4、先给予致炎因素刺激24h后,再分别给予三种不同的干预方式进行处理。我们惊喜的发现,先刺激后干预的处理方式,可以最大程度的降低炎性因子的释放。另外,在三种不同的干预方式中,EPA干预组的效果最好,与其他两种干预方式相比有显著的统计学意义(p0.01)。 5、既然,EPA能有效地抑制促炎因子的产生；接下来使我们好奇的是,它是否能改变抗炎因子IL-10的生成呢?在这里,进一步实验证实了,用LPS刺激24h后的巨噬细胞,给予100μM EPA进行干预,在不同的时间点8h、16h、24h、32h测出IL-10的分泌水平有着显著的提高,并且在24h时,其值达到了顶点(280.32±11.86pg/m1)。更为有趣的是,在这个时间点上,促炎因子TNF-α和IL-6则恰好降到了最低水平。 6、前面的实验数据提示我们,EPA可以显著降低被LPS刺激后的巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α和IL-6的水平,同时提高了IL-10的分泌水平。因此我们会提出疑问：这种作用是否可以间接的通过巨噬细胞作用于肝细胞呢?于是,我们联合培养被LPS刺激后,又用EPA处理过的巨噬细胞和用LPS刺激的肝细胞。结果显示：与未处理组相比,促炎因子TNF-α和IL-6分别降低了85.2%和75.9%。研究结论 1、用LPS和PGE2模拟体外体内炎症,成功的刺激了正常人巨噬细胞和肝细胞分泌出大量的促炎因子TNF-α和IL-6,但不同的细胞对不同的刺激因素反应程度是不同的。 2、EPA、AA以及EPA+AA(比例为1：1)的混合物都有抑制细胞炎症反应的作用,但其中以单独用EPA的效果最好。 3、不同的干预时机,其治疗效果是不同的。从实验数据中我们可以看到：在先于,同时和后于刺激因素给予三种不同的干预方式中,先刺激后干预的效果最为显著。 4、用EPA处理过的细胞,不仅促炎因子TNF-α和IL-6的水平显著降低了,同时,抗炎因子IL-10的水平也显著提高了。有趣的是,这两种作用均在24h时,达到了峰值。 5、通过联合培养EPA处理过且被LPS刺激的巨噬细胞和LPS诱导的肝细胞,检测其促炎因子TNF-α和IL-6水平的变化,我们得出：EPA不仅对巨噬细胞和肝细胞有直接的抗炎作用,而且,可以通过活化的巨噬细胞对肝细胞发挥间接的抗炎作用。创新及意义 1、本研究首次成功培养原代人类外周血单核细胞(演变为巨噬细胞)来比较研究omega-3多不饱和脂肪酸在不同治疗阶段的作用。此外,我们模拟活体内肝脏的真实情况：聚集了大量的肝细胞和Kupffer细胞来设计实验,因此,实验结果更加有说服力。 2、本研究阐述了omega-3多不饱和脂肪酸(EPA)在100u M的浓度下,有效地抑制了被LPS和PGE2刺激的巨噬细胞和肝细胞促炎因子的产生,并且其作用要明显好于omega-6多不饱和脂肪酸(AA)及它们的混合物。这些发现帮助我们回答在临床TPN营养液的配制是单独添加omega-3多不饱和脂肪酸,还是以混合物的方式添加的问题。 3、本研究首次通过联合培养omega-3多不饱和脂肪酸干预的巨噬细胞和LPS刺激的肝细胞,证明EPA不仅可以直接作用于这些细胞,发挥抗炎作用,还可以通过激活的巨噬细胞发挥对肝细胞间接的保护作用。EPA通过两种途径抑制炎症的作用可以很好的解释omega-3多不饱和脂肪酸临床上应用于长期接受TPN患儿,可以有效地预防和缓解PNALD.这为omega-3多不饱和脂肪酸在接受TPN患儿的临床应用方面提供了强有力的理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R720.597

【参考文献】