白藜芦醇甙对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠ERK通路的影响及其改善学习记忆能力的机制研究

发布时间：2018-10-16 16:18

【摘要】：目的：缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是新生儿期危害最大的神经系统疾病之一，常引起新生儿死亡，存活者也存在不同程度的神经系统发育障碍。HIBD发病机制十分复杂，治疗主要采取综合性措施减轻症状，对脑细胞进行保护，尽量减轻脑组织的进一步损害。但是由于围产期脑细胞较成年期容易受损以及治疗窗口期的问题，导致这些治疗措施在新生儿仍需进一步探讨。而且对于成熟脑行之有效的治疗是否在未成熟脑也能够表现出显著的神经保护作用，以及各种治疗方法对于不断发育的脑组织是否具有持续保护作用，仍需更多的研究。值得注意的是，在受到损伤同时，机体还会产生相应的保护性因子对抗损伤反应，如何上调保护性因子水平且降低损伤性因子水平是临床治疗的重要靶点。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是突触可塑性和记忆的重要调节因子，在HIBD修复中起着重要的神经保护作用，而MAPK/ERK信号通路的激活可以反馈性抑制神经元的兴奋性毒性，起到神经保护作用，在各种细胞内信号激酶瀑布链中,细胞外信号调节激酶ERK是脑源性神经营养因子发挥保护作用最可能的细胞内机制。脑缺氧缺血后磷酸化ERK的高表达可能是内源性神经保护反应的结果。缺氧缺血脑损伤后，即刻早基因(Immediate-early Genes,IEGS)如c-Jun在短期内迅速表达，导致了一些后期效应基因被抑制或激活，最终神经细胞坏死、凋亡。因此采用药物维持保护性信号通路的激活，上调脑损伤保护性神经营养因子水平，同时下调引起早期神经损伤的因子如c-Jun的水平，是临床治疗缺氧缺血性脑损伤的重要思路。已有的研究和我们的前期研究工作证明，中药单体白藜芦醇甙（Polydatin,PD）对心脑血管具有十分明显的保护作用，它具有调节血管张力，抑制血小板聚集，改善微循环，保护血管内皮、抗氧化等作用，并对脑缺氧缺血后急性期的大脑组织细胞损伤具有一定的保护作用。目前，应用PD治疗急性脑梗塞、帕金森病以及老年性痴呆均已取得很好的临床效果。这些基础研究和临床实践的结合为长期寻找一种有效治疗新生儿HIBD的潜力药物提供了新思路，更为重要的是它体现了整体调节效应的中药治疗疾病宗旨。但是迄今为止，有关PD对未成熟脑HIBD后远期学习记忆能力的影响及其作用机制的研究甚少。基于以上研究和理论基础，我们提出设想，将PD运用到新生大鼠HIBD的治疗，研究缺氧缺血性脑损伤对于新生大鼠远期学习记忆能力的影响，进一步探讨PD对于HIBD新生大鼠远期学习记忆能力的保护作用，从蛋白水平通过ERK通路以及神经保护性因子BDNF表达进一步探讨其对于HIBD新生大鼠学习记忆能力保护作用的可能机制，并从即刻早基因c-Jun表达进一步研究其神经保护机制，旨在进一步明确PD对HIBD的保护作用及机制，为PD在新生儿HIE中的临床应用提供实验基础和理论依据。方法： 1.7日龄SD大鼠随机分为三组:假手术对照组（NS组），缺氧缺血组（HI组），PD干预组（PD组）。分离并结扎左侧颈总动脉2小时后吸入含氧8%的氮氧混合气体2小时参照Rice方法制备新生大鼠HIBD模型。NS组仅游离左颈总动脉但不结扎和行缺氧处理，PD组在缺氧缺血后每天腹腔注射0.1％PD10mg/kg10天，NS组和HI组注射等体积无菌生理盐水。缺氧缺血损伤后24小时、10天及21天三个时间HE染色光镜下观察各组大鼠皮层、海马区脑组织病理结构的变化。缺氧缺血损伤后21天采用Y-迷宫和跳台实验评估大鼠学习记忆功能的变化。 2.给予PD组新生大鼠0.1％PD10mg/kg干预治疗1天，NS组和HI组注射等体积无菌生理盐水1天，在缺氧缺血后24小时Western Blot方法检测各组大鼠左侧海马p-ERK，p-CREB表达的变化，免疫组化方法检测左侧皮层、海马CA1区、CA3区及DG区c-Jun表达的变化，Western Blot方法检测左侧海马c-Jun表达的变化。 3.给予PD组新生大鼠0.1％PD10mg/kg干预治疗10天，NS组和HI组注射等体积无菌生理盐水10天，免疫组化方法检测各组大鼠缺氧缺血后24小时、10天及21天三个时间点左侧皮层、海马CA1区、CA3区BDNF的表达变化。WesternBlot方法检测缺氧缺血后24小时、10天及21天三个时间点大鼠左侧海马BDNF的表达变化。结果： 1. Y-迷宫实验结果显示,在第一天的学习测试和第二天的记忆保持测试中，同NS组比较，HI组全天总反应时间显著延长（P 0.01）、错误反应次数增加（P0.01），主动回避率减少（P0.01）。同HI组比较，PD组全天总反应时间显著减少（P0.01）、错误反应次数减少（P0.01），主动回避率增加（P0.01）。 2.跳台实验结果显示,同NS组比较，在第一天学习测试中，HI组反应时间延长（P0.01），错误次数增加（P0.01），在第二天记忆保持测试中，HI组潜伏期缩短（P0.01），错误次数增多（P0.01）。同HI组比较，在第一天学习测试中，PD组反应时间短于HI组（P0.05），错误次数少于HI组（P0.01）,且错误次数与NS组比较无差异(P0.05)。在第二天记忆保持测试中，PD组潜伏期长于HI组（P0.05），错误次数少于HI组（P0.01）,且错误次数与NS组比较无差异(P0.05)。 3.缺氧缺血损伤后24小时，Western Blot结果显示NS组大鼠海马有p-ERK、p-CREB蛋白的基础表达，HI组大鼠海马p-ERK、p-CREB蛋白表达较NS组明显增高（P0.01），PD组大鼠海马p-ERK、p-CREB蛋白表达同HI组相比明显增高（P0.01）。 4.免疫组化结果显示，缺氧缺血损伤后24小时,HI组大鼠左侧皮层及海马CA1区、CA3区BDNF表达同NS组相比较明显增高（P0.01）,10天仍高于NS组（P0.01），随着损伤时间延长，HI组BDNF的表达逐渐回落,在21天HI组皮层及海马CA1区、CA3区BDNF表达同NS组相比无统计学差异（P0.05）。PD组呈现出同样的趋势，缺氧缺血损伤后24小时,PD组左侧皮层及海马CA1区、CA3区BDNF表达同NS组相比较明显增高（P0.01），皮层、海马CA1区与HI组相比较无统计学差异（P0.05），CA3区BDNF的表达高于HI组（P0.05），缺氧缺血损伤后10天PD组皮层及海马CA1区、CA3区BDNF的表达高于HI组（P0.05），21天PD组皮层及海马CA1区、CA3区BDNF的表达高于HI组（P0.05）。大鼠左侧海马BDNF Western Blot结果同免疫组化结果相近，缺氧缺血后，HI组及PD组海马BDNF表达同NS组相比增高，后随着时间延长逐渐回落，缺氧缺血损伤后21天HI组已降至NS组水平，PD组在24小时（P0.05）、10天（P0.01）及21天（P0.05）BDNF表达高于HI组。 5.缺氧缺血损伤后24小时,HI组左侧皮层、海马CA1、CA3及DG区免疫组化结果可见c-Jun阳性表达明显高于NS组（P0.01），PD组较HI组明显减少（P0.01）。Western Blot显示HI组左侧海马c-Jun的表达HI组高于NS组（P0.01），而PD组的表达低于HI组（P0.01）。 6. HE染色结果显示光镜下NS组左侧大脑半球组织皮层、海马CA1区结构层次清晰，神经细胞形态、结构正常。缺氧缺血损伤后24小时、10天HI组左侧脑组织皮层变薄，海马锥体细胞层数减少，神经细胞排列紊乱，出现细胞肿胀、溶解，有明显神经元缺失、局灶性坏死。缺氧缺血损伤后21天皮层、海马等部位形成胶质瘢痕。PD组在各时间点仍有不同程度的神经细胞变性，但多数神经元结构较完整，海马锥体细胞层细胞形态、排列基本正常。结论： 1. HIBD可以引起新生大鼠脑组织病理改变和学习记忆能力的下降，，应用白藜芦醇甙干预可以减轻脑组织损伤，改善HIBD新生大鼠的学习记忆能力。 2.缺氧缺血性脑损伤后，新生大鼠大脑海马p-ERK及p-CREB表达增加，表明MAPK/ERK信号通路被激活，应用白藜芦醇甙干预能进一步增强海马p-ERK及p-CREB表达，提示白藜芦醇甙干预对于学习记忆的改善作用可能同其作用于MAPK/ERK信号通路有关。 3.缺氧缺血性脑损伤后，新生大鼠脑组织BDNF表达增加，应用白藜芦醇甙干预能进一步增强HIBD新生大鼠大脑皮层及海马BDNF的表达，并且延长其表达时间，这可能是白藜芦醇甙对于HIBD新生大鼠神经保护作用的机制之一。 4.缺氧缺血性脑损伤后，新生大鼠脑组织c-Jun表达增加，应用白藜芦醇甙干预降低HIBD新生大鼠大脑皮层、海马c-Jun的表达，可能对缺氧缺血后的神经元具有早期保护作用。
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【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R722.1;R285.5

【参考文献】