TLR2在骨髓间充质干细胞修复缺氧缺血性脑损伤中的作用及机制

发布时间：2018-10-21 18:20

【摘要】：第一部分骨髓间充质干细胞共培养对H2O2损伤PC12细胞的保护作用目的通过体外MSCs与H2O2损伤的PC12细胞共培养模型，阐明MSCs通过降低凋亡，调节细胞因子分泌，从而对H2O2损伤的PC12细胞发挥神经保护作用，并初步探讨其中TLR2相关信号通路的作用。方法采用不同浓度的H2O（21.0mM，2.5mM，5.0mM)损伤PC12细胞1h，同时以未处理PC12细胞作为对照组，MSCs共培养采用混合培养24h。MTS检测共培养前后PC12细胞的存活能力，LDH含量测定和NO释放实验分析H2O2对神经细胞的毒性作用，Annexin-Ⅴ-EGFP-PI双染试剂盒检测PC12细胞的凋亡情况，钙影像系统检测胞内Ca2+变化，全细胞膜片钳检测PC12细胞的静息膜电位，RT-PCR测定Bcl-2和caspase-3凋亡相关基因mRNA水平表达变化，ELISA试剂盒检测损伤微环境中相关细胞因子的分泌变化，Western Blotting分析TLR2及其信号通路下游核因子NFкB的表达水平。结果（1）经RT-PCR检测，PC12细胞表达神经相关标志MAP-2、NSE和Nestin，免疫荧光结果同样显示PC12细胞内有MAP-2表达。（2）形态学观察发现H2O2浓度为1.0mM组的细胞损伤最轻，与正常对照组相比基本无差别；但随着H2O2浓度的增高，细胞损伤程度逐渐加重。MSCs共培养组细胞形态学提示MSCs促进了神经细胞损伤的修复。（3）MTS分析结果显示，2.5mM和5.0mM组细胞的存活能力较正常对照组分别降低了50%和75%（P㩳0.05vs. control组），而1.0mM组与对照组相比没有显著性差异；MSCs共培养组与其他共培养组（条件培养基共培养组和PC12细胞共培养组）相比，细胞的存活能力更强。（4）在LDH检测实验中，三组经不同浓度H2O2处理的细胞中LDH的分泌均有增加，与未处理组相比均具有统计学差异（P㩳0.05vs.control组）；PC12细胞损伤后的MSCs共培养组比未损伤共培养组中释放的LDH略有增加，但是与PC12单独损伤组相比，LDH增加的幅度减少（P㩳0.05vs. control组）。（5）NO释放测定结果同样表明，各组H2O2不同处理中的NO含量均高于正常对照组，但仅有5.0mM组与对照组之间存在显著性差异（P㩳0.05vs. control组）。在损伤后MSCs共培养组中，NO的浓度却显著低于未损伤共培养对照组，两组间存在统计学差异（P㩳0.05vs. control组）。（6）Annexin-Ⅴ-EGFP-PI的免疫荧光结果显示，随着H2O2浓度的增高，红色标记的细胞核逐渐增多；而在MSCs共培养组中基本未见中晚期凋亡的红色荧光，仅有EGFP标记早期凋亡的绿色荧光出现，并随着H2O2浓度的增高逐渐增多。（7）钙影像检测系统的结果发现，外源性的NMDA可诱导未损伤的PC12细胞胞内Ca2+发生急剧性地外流，而1.0mM和2.5mM H2O2损伤组却对NMDA的刺激没有反应。通过MSCs与损伤PC12细胞共培养后，NMDA刺激可引起2.5mM和5.0mM两组细胞胞内钙缓慢降低，与对照组相比具有统计学差异（P㩳0.05），但1.0mM组与对照组之间没差别。（8）细胞膜片钳结果显示MSCs共培养后2.5mM组较共培养前有更大的静息膜电位，共培养体系中1.0mM组和2.5mM两组较未损伤共培养组具有更大的负值膜电位（P㩳0.05）；而单独损伤各组间无显著性差异。（9）RT-PCR结果显示，在不同浓度H2O2损伤PC12细胞的各组之间Bcl-2和caspase-3mRNA表达变化不大，差异无统计学意义；但在损伤PC12细胞与MSCs共培养组，2.5mM和5.0mM组中Bcl-2mRNA表达水平显著高于未损伤共培养组（P㩳0.05），而1.0mM组和对照组相比无明显差异。与此相反，caspase-3mRNA的表达水平在5.0mM共培养组中呈明显下降趋势。（10）ELISA结果发现，IL-10的分泌在单独的PC12细胞损伤组随着H2O2浓度的增加而逐渐增高，而在共培养组则逐渐降低；IL-6的分泌水平在MSCs共培养组呈现整体剧增趋势；共培养前后损伤微环境中TNF-α、IFN-β、IL-8和NGF等因子的分泌情况在各组间无统计学差异。（11）Western Blotting检测显示：单独损伤组随着H2O2浓度增高，TLR2的表达稍有增强；MSCs共培养后各组TLR2表达水平则逐渐减弱。并且发现NFкB P65的表达趋势与之相同。结论（1）MSCs共培养提高了受损伤PC12细胞的存活能力，同时显著降低了细胞凋亡和坏死，对损伤细胞具有神经保护作用。（2）MSCs可上调Bcl-2、下调caspase-3，同时分泌IL-6调节IL-10的分泌，促进PC12细胞损伤的修复。（3）MSCs改善损伤PC12细胞的修复机制可能是通过TLR2→NFкB信号通路调节下游细胞因子的分泌，在损伤局部微环境中发挥免疫调节作用。第二部分TLR2在骨髓间充质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤中的调节作用目的明确MSCs移植通过调节TLR2信号通路促进HIBD大鼠脑损伤的修复；阐明TLR2信号通路在HIBD过程中的免疫调节作用。方法将180只大鼠随机分为假手术组（sham组）、HIBD造模组、MSCs移植治疗HIBD组（MSCs组）及给予Pam3CSK4干预后HIBD造模组（Pam3CSK4组）。在大鼠7日龄时采用Rice法结扎并离断实验大鼠的左颈总动脉，sham组仅进行颈部皮肤切开后缝合，Pam3CSK4组在HIBD损伤前16h经腹腔注射给予Pam3CSK430μg/只，MSCs组则在HIBD损伤后24h以腹腔注射方式给予原代培养的MSCs1.5×106cells/只。Morris水迷宫检测实验动物的学习记忆功能；Real-timePCR和Western Blotting方法检测HIBD后不同时间点各组大鼠损伤侧海马组织中TLR2的表达变化，并比较分析HIBD与Pam3CSK4两组间TLR2及其相关信号通路因子、凋亡因子Bax的表达情况；ELISA试剂盒测定大鼠损伤侧海马组织中IL-10的分泌水平。结果（1）Morris水迷宫实验发现，HIBD组实验大鼠寻找平台的潜伏期显著长于sham组(P㩳0.05vs. sham组)，而经MSCs移植治疗的实验大鼠寻找平台所用时间则介于sham组和HIBD组之间，与sham组及HIBD组均有显著性差异（P㩳0.05）；在第6d的平台探索实验中，HIBD组实验大鼠停留在平台所在象限的平均时间明显短于sham组，MSCs组则介于两者之间，与HIBD组及sham组之间的差异均有统计学意义（P㩳0.05）。（2）同时发现，随着损伤时间（3d、7d和14d）的延长，HIBD组实验大鼠损伤侧海马组织中TLR2的表达逐渐增强。在对同一时间点不同处理三组（正常对照组、HIBD造模组和MSCs回输组）进行比较，发现HIBD组TLR2的表达水平较sham组高（P㩳0.05vs. sham组）；而MSCs组与HIBD组相比，TLR2的表达水平却呈下降趋势（P㩳0.05vs. HIBD组）。（3）HIBD组大鼠损伤侧海马组织中IL-10分泌水平明显高于sham组（P㩳0.05），而MSCs移植治疗降低了损伤侧海马组织中IL-10的水平（P㩳0.05）。（4）相较于HIBD组大鼠，TLR2特异性激动剂Pam3CSK4显著增加了HIBD实验大鼠寻找平台的潜伏期，并降低了损伤大鼠在平台所在象限停留的平均时间，同时增强了损伤侧海马组织中TLR2、NFкB和Bax的表达水平，并使IL-10的分泌增加。结论MSCs移植通过下调TLR2的表达，降低TLR2信号通路关键核因子NFкB的表达，减少凋亡因子Bax的表达水平及IL-10的分泌，从而促进HIBD模型大鼠学习记忆功能的修复。第三部分TLR2信号通路在骨髓间充质干细胞修复神经损伤中的分子机制目的利用MSCs与OGD损伤PC12细胞共培养模型，通过TLR2特异性激动剂Pam3CSK4或Ad-siRNA激活或沉默TLR2的表达，验证TLR2相关信号通路在MSCs修复神经损伤中的免疫调节作用机制。方法实验设计分为三个组：正常对照组，OGD损伤的PC12细胞组（OGD组）和MSCs与OGD损伤PC12细胞共培养组（MSCs共培养组）。OGD组以EBSS置换正常的细胞培养基，将细胞置于37℃，5%O2+95%N2混合气中培养6h；MSCs共培养组在OGD损伤结束后换为正常培养基，同时等比加入MSCs于37℃，5%CO2细胞培养箱中继续培养24h。应用Real-time PCR和Western Blotting方法检测三组中TLR2、NFкB P65及凋亡因子Bax的表达差异，ELISA检测IL-10的分泌情况。通过TLR2特异性激动剂Pam3CSK4处理（Pam3CSK4组）或感染Ad-siRNA方式（Ad-siTLR2组），激活或抑制PC12细胞中TLR2的表达，进一步验证TLR2信号通路在MSCs修复神经损伤中的免疫调节作用。其中，Pam3CSK4组在OGD损伤PC12细胞前6h给予Pam3CSK4，Ad-siTLR2组则在OGD损伤前感染Ad-siTLR2。结果（1）缺氧缺糖损伤细胞后，形态学观察发现OGD损伤的PC12细胞折光性差，胞体出现明显皱缩，凋亡细胞增多。（2） OGD组与正常对照组相比TLR2的表达呈现增强趋势；而MSCs共培养组中TLR2的表达较OGD组明显降低，两组间差异具有统计学意义（P㩳0.05vs. OGD组）。TLR2下游信号通路关键核因子NFкB P65的表达趋势与TLR2的表达变化基本一致。OGD组中Bax的表达较正常对照组明显升高，细胞凋亡增多；与MSCs共培养后，Bax的表达显著降低（P㩳0.05vs. OGD组）。OGD组细胞培养上清中IL-10的含量明显增多，约为对照组的3倍，但在MSCs共培养组IL-10的分泌较OGD组具有明显地降低（P㩳0.05vs.正常对照组）。（3）Pam3CSK4及Ad-siRNA均可特异激活或抑制TLR2及NFкB的表达，分别与自身对照组相比具有统计学差异（P㩳0.05）。（4）OGD损伤PC12细胞给予Pam3CSK4处理后，TLR2和NFкB P65的表达水平均增强，同时伴随着凋亡因子Bax的升高及IL-10分泌的增多；而感染Ad-siRNA后，TLR2和NFкB P65的表达水平降低，凋亡因子Bax的表达也随之降低，IL-10分泌减少。（5）与MSCs共培养组相比较，Pam3CSK4处理的MSCs共培养组Bax表达及IL-10分泌明显升高，感染Ad-siTLR2的MSCs共培养组中的Bax和IL-10随着TLR2信号减弱而降低。结论（1）Pam3CSK4或Ad-siTLR2可有效调控TLR2及其相关信号通路中NFкB的表达水平。（2）OGD损伤可能通过上调PC12细胞中TLR2信号通路，，增加Bax表达和IL-10的分泌水平，从而导致神经细胞的损伤。（3）MSCs共培养可能通过下调OGD损伤的PC12细胞中TLR2信号通路，减少Bax表达和IL-10的分泌水平，对损伤细胞的修复具有保护作用。（4）在不同处理时细胞分泌IL-10的水平存在差异，提示IL-10与损伤程度密切相关；在MSCs修复神经损伤的过程中IL-10发挥重要的调节作用。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R722.1

【参考文献】