选择性激活胆碱能神经元MeCP2对小鼠Rett综合征样表型的改善作用及其机制研究

发布时间：2018-11-14 15:40

【摘要】：Rett综合征(RTT)是一种主要发生于女性的、X-连锁的进行性神经发育性疾病,是女性智障的主要遗传因素之一。其临床特征为:出生后经历6-18个月正常发育后,出现生长发育迟缓,习得运动、语言能力、智力退化,并出现手部刻板动作及孤独症样社交障碍,常伴有呼吸功能异常、癫痫发作等,晚期运动能力丧失。RTT主要由MeCP2基因突变所致,MeCP2蛋白全称甲基化CpG结合蛋白,作为一种转录调控因子和染色质调节因子,主要通过调控与神经元成熟和功能维持相关基因的表达,从而,对维持正常脑功能发挥起关键作用。探讨MeCP2突变导致RTT的病理生理机制对于研发有效的对因治疗手段至关重要。条件性敲除MeCP2动物模型研究表明,不同神经元类型,包括兴奋性神经元、中间神经元、儿茶酚胺能调制性神经元等,均不同程度地参与了 RTT症状的不同方面,提示RTT发生的神经元类型特异性,为发展针对某一类神经元的靶向并治疗提供了支持证据。尤其是基于MeCP2-null模型的研究,因类似于MeCP2突变导致的人类疾病状态,在此基础上,探讨改善某一类神经元功能对症状表型的逆转效果,可为寻求RTT的靶向治疗手段提供较为直接的证据。胆碱能神经元是脑内重要的调制系统之一,主要通过对多个脑区的广泛投射、释放乙酰胆碱递质,调控包括上述RTT相关神经元类型(GABA能中间神经元和儿茶酚胺能神经元等)在内的非胆碱能神经元,从而对维持脑的兴奋/抑制平衡和多巴胺能神经元局部微环路功能等均具有重要作用。因此,我们把胆碱能神经元作为候选目的神经元类型,研究其参与小鼠RTT样表型的特异性作用及其机制。目的:1在Rett综合征小鼠(缺失MeCP2)中,选择性激活其胆碱能神经元中MeCP2。2检测胆碱能神经元MeCP2选择性激活对小鼠Rett综合征样表型的影响:1)探讨在MeCP2缺失小鼠中,选择性激活小鼠胆碱能神经元MeCP2能否有效逆转多数RTT样症状,从而揭示胆碱能MeCP2在RTT综合征发病和治疗中地位;2)进一步探讨胆碱能MeCP2选择性激活影响(改善)RTT样表型的分子机制。从而揭示小鼠Rett综合征样表型机制。方法:1通过Chat-Cre;MeCP2lox-Stop系统,选择性删除胆碱能神经元中阻断MeCP2表达的Lox-Stop-Lox序列,从而,产生MeCP2仅在胆碱能神经元中被激活而正常表达的小鼠模型。2采用1)各种行为学检测方法,系统地检测选择性激活胆碱能神经元MeCP2小鼠模型的RTT样表型,主要包括:小鼠运动功能(旷场试验)、前肢抓力、焦虑样行为(旷场和高架十字迷宫)、社交行为(三箱试验)、感觉运动门控功能(PPI检测),和小鼠一般状况表型评估(症状严重程度评分等);2)Western blot方法,探讨胆碱能MeCP2选择性激活对脑内胆碱能系统主要候选分子Chat和Chrna7表达水平的影响。揭示胆碱能MeCP2对小鼠RTT样表型的贡献。结果:1小鼠模型验证:1)对Chat-Cre;MeCP2lox-Stop系统繁殖对所产生的子代雄性实验小鼠进行基因型鉴定分组,包括野生型WT对照组、Cre对照组、MeCP2-Stop组和选择性激活胆碱能MeCP2的Rescue组。2)进一步免疫荧光检测,比较各组小鼠MeCP2原位表达情况及其与胆碱能神经元标志物Chat的共定位情况,从而,验证特异性保留胆碱能MeCP2表达的有效性。结果显示:Rescue组中,绝大多数Chat阳性神经元中MeCP2表达被保留,可用于进一步研究胆碱能MeCP2对小鼠RTT样症状的改善效果,揭示小鼠各种RTT样表型的机制。2小鼠RTT样表型检测:1)小鼠运动能力检测:(1)旷场测试15分钟(6-7周),(2)小鼠前肢抓力检测(8-9周)。结果显示:Stop组小鼠表现的各项运动功能减低指标,在Rescue组中均得到逆转并达到WT和Cre对照组水平。包括:每5分钟运动的距离,不动的总时间,大速率(10cm/s)运动的距离,及总运动距离。前肢抓力水平低下也得到相应改善、达到对照组水平。2)小鼠焦虑水平测试:(1)旷场试验头5分钟表现(6-7周),(2)高架十字迷宫(EPM)(6-7周)。结果显示:Stop组小鼠在旷场中的焦虑水平增高表型,表现为在旷场中央区域的时间和运动距离减低,与之相比,Rescue组小鼠这2项焦虑指标均得到显著逆转、达对照组水平。然而,在EPM中,Rescue组小鼠和小鼠Stop均表现出相似的异常焦虑水平,表现为在EPM开臂中经历的绝对时间及其所占百分比均增高。3)小鼠社交行为测试——三箱试验结果表明:Stop小鼠与陌生小鼠或再次引入的新陌生小鼠之间的交流时间及其偏好指数,较对照组,均表现为异常增加,这一表型在Rescue小鼠中未得到逆转。4)小鼠感觉运动门控功能检测,结果显示:Stop小鼠感觉运动门控功能无明显异常,胆碱能MeCP2 Rescue对小鼠感觉运动门控功能也无明显改变效应。5)小鼠一般状况表现评估:(1)体重(6-15周,1次/周),(2)表型严重程度评分(6-15周,1次/周),(3)心率(8周),(4)脑重(8周),(5)寿命。结果显示:相对于Stop组小鼠的低体重、严重程度分值进行性增加、心率减低、低脑重和早期死亡表型,在保留胆碱能MeCP2的Rescue小鼠中,上述表型均无显著改善。3选择性激活胆碱能神经元MeCP2改善小鼠RTT样表型的分子机制探讨通过Western blot进一步探讨上述行为改善的可能机制,结果显示:候选分子胆碱能神经元标志物Chat水平及其受体Chrna7全脑表达水平,在Stop和Rescue小鼠中均无明显改变,提示胆碱能MeCP2可能并非通过影响胆碱能神经元本身递质合成及RTT相关的乙酰胆碱受体Chrna7水平这一通路,而维持胆碱能神经元功能、并影响RTT样表型。结论与讨论:1选择性激活胆碱能神经元MeCP2,足以有效逆转MeCP2缺失所致运动功能低下。揭示了胆碱能MeCP2对维持小鼠正常运动功能的充分性作用。2选择性激活胆碱能神经元MeCP2,可有效逆转MeCP2缺失所致焦虑样行为,但对小鼠在EPM中焦虑水平异常减低,无逆转效应。提示胆碱能MeCP2可能具有下调小鼠焦虑水平的功能,但不足以维持小鼠正常焦虑表型,因而,小鼠正常焦虑样表型的维持,尚需非胆碱能神经元的参与。3胆碱能MeCP2对于MeCP2缺失所致的小鼠社交水平异常增高现象无逆转效应,提示小鼠正常社交水平的维持,可能主要依赖于非胆碱能神经元的作用。4胆碱能MeCP2对于MeCP2缺失所致低体重、低脑重、低心率,表型严重程度评分累加及寿命明显缩短等一般状况的改善,可能不是必要的。提示在脑内所占数量有限的胆碱能神经元中MeCP2不足以维持小鼠正常一般状况表型。尽管胆碱能神经元功能可广泛调控多种非胆碱能系统,但小鼠一般状况的维持,可能主要依赖于非胆碱能系统本身的功能。而处于上游的胆碱能MeCP2,对这一功能无代偿效应,进一步支持MeCP2在神经元中主要通过细胞自主性(cell-autonomous)方式发挥其维持神经元功能的作用。5胆碱能MeCP2可能并非通过影响胆碱能神经元本身递质合成关键酶Chat及RTT相关的乙酰胆碱受体Chrna7水平这一通路,从而维持胆碱能神经元功能并影响小鼠RTT样表型。本课题首次采用选择性激活胆碱能神经元MeCP2小鼠模型,进一步揭示了胆碱能系统中MeCP2在RTT表型及其缓解中的作用,也为胆碱能神经系统相关治疗对有效改善RTT患者运动能力低下和焦虑症状的潜能提供了支持证据。其中的神经环路机制和分子机制,仍有待于进一步研究阐明。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R725.9

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