酸敏感离子通道在过敏性紫癜患儿血管内皮损伤中的调控作用

发布时间：2019-01-01 08:07

【摘要】：目的本研究通过观察过敏性紫癜(HSP)患儿血清a Ig A1和胞外酸刺激对体外培养的人皮肤微血管内皮细胞(HDMECs)中酸敏感离子通道(ASICs)表达的影响,及其对炎症因子分泌和细胞骨架蛋白表达的影响,并且观察酸敏感离子通道阻断剂对内皮细胞损伤的保护作用,探讨ASICs在HSP患儿血管内皮细胞炎性损伤中的调控作用。方法1.样本采集及聚合Ig A1(a Ig A1)的分离及纯化选取本院2015年1月至2015年6月初发急性期HSP患儿10例,另外选取10名健康体检儿童作为正常对照组。抽取所有受试者清晨空腹状态下5ml外周静脉血,离心分离血清,用Jacalin亲和层析法及蛋白纯化法提取血清a Ig A1。2.实验分组将分化成熟的HDMECs消化后培养于六孔板中。预实验中,将六孔板细胞分为四组:1组为p H6.0组;2组为p H6.5组;3组为p H7.0组;4组为p H7.4组,每组三孔,将Hepes液依次加入1、2、3、4组,调整培养液p H值分别为6.0、6.5、7.0、7.4,培养4h。另外将六孔板细胞分为十组:1组为空白对照组;2组为p H6.5组;3组为正常Ig Al组;4组为正常Ig Al+p H6.5组;5组为正常Ig Al+p H6.5+阿米洛利组;6组为正常Ig Al+p H6.5+Pc TX1组;7组为HSP Ig Al组;8组为HSP Ig Al+p H6.5组;9组为HSP Ig Al+p H6.5+阿米洛利组;10组为HSP Ig Al+p H6.5+Pc TX1组,每组3个孔;将健康儿童或HSP患者血清的a Ig A1加入六孔板中,3-6组加健康儿童a Ig Al,7-10加HSP患者a Ig A1,并调整培养基中a Ig A1最终浓度250μg/ml,培养6h后弃去上清液;5组、9组加入阿米洛利100μmol/L,6组、10组加入Pc TX1 20nmol/L,0.5h后,将Hepes液依次加入2、4、5、6、8、9、10组,调整培养基p H值为6.5,培养4h。3.IL-8、NO和TM的浓度测定采用酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测细胞上清液中IL-8、NO和TM水平。4.分析ASICs、destrin和SM-αm RNA和蛋白的表达分别采用实时定量聚合酶链反应(q PCR)和蛋白免疫印迹法(WB)分析实验组ASIC1a、ASIC2a、ASIC3、destrin and和SM-αm RNA和蛋白的表达情况和预实验组ASIC1a、ASIC2a、ASIC3 m RNA表达情况。结果1、预实验中,p H6.5组HDMECs中的ASIC1a、ASIC2a、ASIC3 m RNA表达量较其他三组明显增多,差异均有统计学意义(P均0.05);2、细胞外酸化和HSP患儿血清a Ig A1能诱导HDMECs中酸敏感离子通道(ASIC1a、ASIC2a、ASIC3)表达上调,p H6.5组和HSP Ig Al组较空白对照组及正常Ig Al组ASICs表达量多,且HSP Ig Al+p H6.5组较HSP Ig Al组ASICs表达量多,差异均有统计学意义(P均0.05);3、细胞外酸化和HSP患儿血清a Ig A1能刺激HDMECs中IL-8、TM及NO释放,p H6.5组和HSP Ig Al组均较空白对照组及正常Ig Al组IL-8、TM及NO释放量明显增多,且HSP Ig Al+p H6.5组较HSP Ig Al组IL-8、TM及NO释放量明显增多,阿米洛利和Pc TX1能够抑制炎症因子的过多释放,HSP Ig Al+p H6.5+阿米洛利组和HSP Ig Al+p H6.5+Pc TX1组较HSP Ig Al+p H6.5组IL-8、TM及NO释放量减少。此外,在HSP Ig Al+p H6.5组中,IL-8、TM、NO水平分别与ASIC1a m RNA表达水平呈正相关关系(R=0.947,0.864,0.829);IL-8、TM、NO水平分别与ASIC2a m RNA表达水平呈正相关关系(R=0.833,0.827,0.874);IL-8、TM、NO水平分别与ASIC3 m RNA表达水平呈正相关关系(R=0.777,0.851,0.693),差异均有统计学意义(P均0.05);4、细胞外酸化和HSP患儿血清a Ig A1能减少HDMECs中细胞骨架蛋白(destrin、SM-α)的表达,p H6.5组和HSP Ig Al组均较空白对照组及正常Ig Al组destrin、SM-α表达量明显减少,且HSP Ig Al+p H6.5组较HSP Ig Al组destrin、SM-α表达量明显减少,阿米洛利和Pc TX1能够抑制destrin、SM-α的表达减少,HSP Ig Al+p H6.5+阿米洛利组和HSP Ig Al+p H6.5+Pc TX1组较HSP Ig Al+p H6.5组destrin、SM-α表达量多,此外,在HSP Ig Al+p H6.5组中,destrin和SM-αm RNA的表达水平与ASIC1a m RNA表达水平呈负相关关系(R=-0.713,-0.867),destrin和SM-αm RNA的表达水平与ASIC2a m RNA表达水平呈负相关关系(R=-0.842,-0.798),destrin和SM-αm RNA的表达水平与ASIC3 m RNA表达水平呈负相关关系(R=-0.671,-0.742),差异均有统计学意义(P均0.05);结论细胞外酸化和HSP患儿血清a Ig A1均能诱导体外培养的HDMECs中酸敏感离子通道(ASICs)的表达上调,引起炎症因子的大量释放及细胞骨架蛋白下调,造成内皮细胞受损;其中,胞外酸化作用更强。而ASICs阻断剂能抑制这些效应,对血管内皮细胞损伤有显著的保护作用,从反面也证明了ASICs可能参与了血管内皮细胞的炎症损伤过程。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R725.5
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本文编号：2397249