454高通量测序技术应用于粪便中病毒的发现与分析

发布时间：2019-01-07 19:27

【摘要】：背景：新发传染病始终威胁着人类的健康。发现和鉴定新病毒以及确定新病毒与疾病的关系是预防、诊断和治疗新发病毒性传染病的首要任务。高通量测序技术突破了传统技术方法的局限,可以直接以标本中所有的遗传物质为研究对象,从而能够快速地鉴定出标本中存在的病毒,形成了一门研究特定环境中病毒群落的新兴学科：病毒宏基因组学。传统意义上有很多用于发现新病毒的方法,但利用高通量测序发现新病毒具有信息量大、对标本所含信息无偏倚等独特优点,使得该技术已成为目前病毒发现最为重要的前沿技术之一。在短短的几年里,人们依靠这种技术发现了很多有意义的病毒,研究领域涉及到人类、动物、环境、水体等,充分显示出其在病毒诊断、溯源、预警等方面的实用意义。腹泻是各个年龄段的人类和动物中常见的疾病,可由细菌、病毒和寄生虫等病原引起,而轮状病毒、杯状病毒、肠道腺病毒和星状病毒是引起人类腹泻最主要的病毒性病原。在世界范围内,每年有200多万5岁以下腹泻儿童死亡,并且发展中国家占有较大的比例。现有的检测技术只能发现60%的腹泻病例的病原,仍有近40%的病例查不出具体病原。其中部分腹泻的未知病因可能是目前暂未被发现的病毒。腹泻在儿童中的发生率远高于成人,严重影响了儿童的健康,分析腹泻儿童与健康对照儿童粪便标本中的病毒群落差异以及发掘潜在的新病毒将为诊断不明腹泻的病因提供新的途径。此外,猪作为与人类接触最为密切的经济动物之一是人兽共患病的重要宿主,被认为是天然的病原体库。因此,开展其粪便中病毒谱的研究对预警潜在的人类新发病毒病也具有重要意义。方法： 1、以猪的粪便标本为研究对象,摸索并建立适用于454高通量测序的粪便标本处理方法；通过对海量序列进行生物信息分析,研究猪粪便中的病毒谱,发现潜在的新病毒；进一步利用生物信息学、分子生物学与免疫学等方法,了解新病毒的基因结构、分子流行病学及血清流行学等特点,初步探索新病毒在人类中存在感染的潜在可能。 2、应用454高通量测序分析了腹泻与健康儿童粪便标本中的病毒性病原组成情况；采用统计学方法分析了主要病毒性病原的种类与序列数量在两类标本中的差异；通过序列同源性比对分析,发现潜在的新病毒序列,并了解其在两类不同标本中的检出情况。结果：从9份健康猪的粪便标本中共获得40万余条序列,平均长度达361bp,其中病毒序列为5437条,涉及病毒种类达20余种；基因序列与进化树分析表明标本中存在多株不同的新型星状病毒、博卡病毒和类双埃可病毒,且这些病毒在健康猪粪便标本中广泛存在,检出率分别为：51.5%、72%和13.5%。对新型的类双埃可病毒PLV-CHN进行深入分析显示,该株病毒基因组全长为6832bp,编码一个长为2132个氨基酸的完整多聚蛋白,与已知双埃可病毒属的Ljungan病毒有最大同源性(氨基酸同源性为32%)。值得注意的是,在本研究整理相关结果时,法国报道了一株与PLV-CHN极为类似的病毒SPaV1,核苷酸与氨基酸同源性分别达到82%和89%,基因特点与进化分析均显示PLV-CHN与SPaV1最为相近,二者形成了小RNA病毒科的一个新的属——Pasivirus。对该病毒3D区进行的分子流行病学显示,健康猪粪便标本的检出率为20%；腹泻与正常儿童粪便以及脑炎儿童脑脊液中均未检出该病毒。但ELISA结果表明健康人群的血清中该病毒或与该病毒相关的抗体阳性率高达63.5%,其中12岁之前的绝大部分儿童显示血清阳性。腹泻与对照儿童粪便标本中获得的序列数量分别为385288条与290647条,两类标本中的病原组成种类无明显差别,除去未分类序列,细菌、噬菌体与病毒序列的数量在两类标本中均占据前三位。而对病毒宏基因组分析显示,病毒的序列在两类标本中的数量差别较大,分别为7744条和1949条；主要病毒序列组成也不尽相同：腹泻组标本中前三位的病毒依次为Anellovirus、杯状病毒和Salivirus,正常组标本中前三位的病毒依次为Anellovirus、 Tymovirus和HPeV;其中Anellovirus在两类标本中的阳性率和序列数量的差异均无统计学意义,而诺如病毒、札如病毒和Salivirus的阳性率和序列数量在两类标本中均具有统计学差异,显示了与儿童腹泻的相关性；而其中的GIV型诺如病毒是首次在中国腹泻儿童粪便标本中发现。此外,在腹泻儿童标本中,出现大量与已知病毒同源性很低的序列,其中5个序列读长为具有潜在意义新病毒的序列,分别与Densovirus、鼠细小病毒、未分类densovirus、蛙腺病毒和乳头瘤病毒最匹配,且氨基酸同源性均50%。结论： 1、猪粪便中存在多种新病毒序列,表明猪是病毒多样型的生物库,在人类病毒病的预警研究中要给与重视。 2.我国健康猪中发现了全新的类双埃可病毒PLV-CHN,它与法国同期发现的SPaV1形成了小RNA病毒科的一个新的属——Pasivirus。 3、人类儿童早期可能存在全新的小RNA病毒科新属(Pasivirus)成员(如PLV-CHN)的感染。 4、腹泻与对照儿童粪便标本中的病原组成、种类与数量存在差异,其中部分病毒的潜在意义还需要深入探讨。 5、儿童腹泻标本中发现了五个新病毒序列,其生物学意义及与腹泻的相关性有有待深入研究。 6、中国腹泻儿童中第一次报道诺如病毒GIV型的存在。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R725.7;S852.65

【参考文献】