二甲双胍对雌鼠性早熟伴胰岛素抵抗与脂肪芳香化酶作用的研究

发布时间：2019-04-21 21:32

【摘要】：目的:1.建立性早熟伴胰岛素抵抗雌鼠模型,测定雌二醇水平及其脂肪组织中芳香化酶表达、mRNA转录水平,应用二甲双胍进行药物干预后测定雌激素水平及脂肪组织芳香化酶表达变化,并与对照组进行比较。探讨二甲双胍在改善糖代谢、脂代谢及胰岛素抵抗的同时,对雌激素水平及脂肪组织芳香化酶表达的影响,为临床应用二甲双胍治疗胰岛素抵抗的同时改善女童性早熟提供更多理论依据。2.应用细胞培养技术建立3T3-L1胰岛素抵抗脂肪细胞模型,以不同浓度二甲双胍进行实验干预,并以丙酸睾酮作为催化反应底物,观察脂肪细胞在胰岛素抵抗情况下芳香化酶表达及其活性,同时观察二甲双胍干预对芳香化酶表达的影响是否与MEK/ERK信号通路有关,并进一步讨论其干预的分子水平机制。方法:1.正常断乳(21天)SD雌性幼鼠45只,随机分为普通饮食组(NC组10只)和高脂饮食组(FC组35只),每日观察雌鼠阴门开启情况并记录阴门开启日龄。对比NC组阴门开启日龄,将FC组分为阴门早开组即性早熟组(FC-P组),对其进行称重、取血测雌二醇及空腹胰岛素水平,行OGTT并测定各时间点血糖,结果显示存在胰岛素抵抗,证明性早熟伴胰岛素抵抗雌鼠造模成功,并将其随机分为模型组(IR组)、低剂量治疗组(IR-L组)和高剂量治疗组(IR-H组)。治疗组分别给予不同剂量二甲双胍(Metformin,Met)灌胃治疗6周。测量给药前后大鼠的体重,并在实验结束时取血检测各组大鼠的空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、雌二醇(E2)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL),计算稳态模型胰岛抵抗指数(HOMA-IR);处死各组大鼠并取肾周及卵巢周围脂肪进行称重,计算脂体比;应用蛋白免疫印迹法(western blot)及实时荧光定量(RT-PCR)检测脂肪组织中芳香化酶的表达及其mRNA转录水平。2.应用细胞培养技术对3T3-L1前脂肪细胞进行培养以及诱导分化。参考相关文献对前脂肪细胞的分化方法,对细胞进行诱导分化:将培养状态良好的3T3-L1前脂肪细胞接种于培养皿,加入含地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)的培养液进行逐步诱导分化,至第9天90%以上的细胞呈成熟脂肪细胞表型,可用于后续试验。细胞内可见明显脂滴,采用油红o染色法进行成熟脂肪细胞鉴定。胰岛素抵抗脂肪细胞模型的建立:对已经诱导分化成熟的3t3-l1脂肪细胞进行分组处理,采用高糖/高胰岛素处理脂肪细胞,测定培养液上清中葡萄糖含量并计算其消耗量,以葡萄糖消耗量及消耗率反映脂肪细胞胰岛素抵抗程度。在成功建立胰岛素抵抗脂肪细胞模型基础上,观察细胞中芳香化酶表达、基因转录水平的变化,以及不同浓度二甲双胍对其影响:设空白对照组、胰岛素抵抗模型组、不同浓度二甲双胍干预组(10-5、10-4、10-3mol/l)。药物处理48h后应用westernblot及rt-pcr方法检测各组脂肪细胞中芳香化酶的表达及其mrna转录水平;同时应用酶联免疫方法,以丙酸睾酮为底物,测定各组培养液中雌二醇浓度,以了解各组细胞中芳香化酶催化活性。在胰岛素抵抗脂肪细胞模型+10-3mol/l二甲双胍组中加入mek抑制剂(pd98059),观察加入pd98059后芳香化酶表达、mrna转录水平变化。结果:1.高脂饲料喂养的雌鼠可出现性早熟、肥胖,表现为阴门开启时间提前、体重及体内雌激素水平升高(p0.05);并同时伴有胰岛素抵抗。二甲双胍可降低胰岛素抵抗雌鼠体重、内脏脂肪重量及脂体比(p0.05)。二甲双胍在调节糖、脂代谢的同时改善胰岛素抵抗、降低雌鼠体内雌激素水平(p0.05);且二甲双胍呈剂量依赖性下调糖代谢指标及雌激素水平。性早熟伴胰岛素抵抗雌鼠脂肪组织芳香化酶表达及基因转录水平均较正常饮食雌鼠升高,二甲双胍呈剂量依赖性下调性早熟伴胰岛素抵抗雌鼠脂肪组织芳香化酶表达及其基因转录水平(p0.05)。2.采用高糖/高胰岛素培养方法,可将诱导分化成熟的3t3-l1脂肪细胞建立为胰岛素抵抗脂肪细胞模型。胰岛素抵抗脂肪细胞中芳香化酶表达量升高,二甲双胍呈剂量依赖性下调胰岛素抵抗脂肪细胞中芳香化酶的表达及雌激素的产生(p0.05)。加入mek抑制剂后,二甲双胍下调胰岛素抵抗脂肪细胞芳香化酶的作用减弱。结论:1.高脂饲料喂养的雌鼠可出现性早熟、肥胖及胰岛素抵抗。2.二甲双胍在调节性早熟伴胰岛素抵抗雌鼠糖、脂代谢的同时,改善其胰岛素抵抗。3.胰岛素抵抗状态下雌二醇水平升高,脂肪组织及脂肪细胞芳香化酶表达水平升高4.二甲双胍呈剂量依赖性下调胰岛素抵抗状态下脂肪组织和脂肪细胞中芳香化酶的表达及其基因转录水平。5.二甲双胍呈剂量依赖性下调胰岛素抵抗状态下升高的雌激素水平。6.二甲双胍可能通过MEK/ERK信号通路下调胰岛素抵抗脂肪细胞中芳香化酶的表达。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R725.8

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