GATA1在经p38MAPK信号通路介导表观遗传修饰调控γ珠蛋白基因表达中的作用

发布时间：2019-05-13 23:40

【摘要】：背景与目的 β-蛋白生成障碍性血发病机制及治疗现状 β-珠蛋白生成障碍性贫血(β-thalassemia)是世界上最常见的常染色体隐形遗传病之一,其发病机制是β珠蛋白基因的突变或缺失,导致p珠蛋白链合成减少(β+)或完全不能合成(β0),相对过剩的α肽链形成包涵体沉积于细胞膜上,引起红细胞膜的氧化损伤、变形能力下降和携氧能力的改变,使红细胞寿命缩短、在脾脏内被大量破坏而引起溶血性贫血。目前β-珠蛋白生成障碍性贫血的确切治愈方法只有造血干细胞移植,但是价格高昂、配型成功率低等问题限制了其广泛应用。胎儿血红蛋白(etal hemoglobin, HbF)合成的增加可以代偿缺失的p珠蛋白链的功能,与相对过剩的a链构成胎儿血红蛋白,降低α链与非α链之间的不平衡,减轻a链包涵体所致的原位溶血。因此,可以重新激活红系细胞中已近乎关闭的γ珠蛋白基因的诱导药物成为目前的研究热点之一。 γ珠蛋白基因诱导药物及其作用机制 1982年国外首次报告应用5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-AZAC)治疗β-珠蛋白生成障碍性贫血患者取得较好疗效之后,国内外对γ珠蛋白基因诱导剂进行了大量研究,目前已知的Y珠蛋白基因诱导剂大致可分为：①DNA甲基转移酶抑制剂,如5-AZAC和地西他滨(decitabine)等；②组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制剂,如曲古霉素A (trichostatin A, TSA)和apicidin等；③短链脂肪酸及其衍生物,如丁酸盐类及其衍生物和丙戊酸等；④细胞毒性药物,如羟基脲(hydroxyurea, HU)等；⑤免疫调节药物,如thalidomide和pomalidomide等；⑥激素类药物,如黄体酮等；⑦细胞因子,如促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)等；⑧天然来源的药物：如呋喃香豆素(Furocoumarins)、雷帕霉素(Rapamycin)、白藜芦醇(Resveratrol)和我们课题组发现的黄芪多糖等。一些药物如HU和EPO等已用于临床并在缓解贫血症状方面取得了一定的疗效,但是这些药物也存在着许多不足,如有效剂量接近中毒剂量、远期疗效和安全性仍有待观察、部分病人对于治疗没有反应、半衰期短和价格昂贵等,在临床应用上受到很大限制。因此,探索Y珠蛋白基因诱导剂的作用机制,进而开发更为安全有效、适于临床应用治疗p-珠蛋白生成障碍性贫血的新药是目前的研究重点。 Y珠蛋白基因诱导剂的作用机制十分复杂,国内外对其进行了大量研究,研究者们早期认为Y珠蛋白基因诱导剂可以通过抑制DNA合成(如HU)或者改变红系细胞动力学加速红系细胞分化(如白藜芦醇)等重新激活γ珠蛋白基因。近十年来细胞信号通路、表观遗传修饰和转录因子在γ珠蛋白基因诱导剂中的作用被诸多报道所证实。来自羊、灵长类和人类的实验结果提示在成人γ珠蛋白基因药物诱导中发挥作用的信号通路包括丝裂原活化蛋白激酶(mito gen-activated protein kinases, MAPKs)信号通路、可溶性鸟苷环化酶(Soluble guanylyl cyclase,sGC)和cGMP信号通路、PKG信号通路等。随后,研究者们发现γ珠蛋白基因诱导剂可以改变染色质结构,促进γ珠蛋白基因启动子区转录因子的结合,从而上调γ珠蛋白基因基因表达,例如抑制]3DAC活性(如TSA)和促使γ珠蛋白基因启动子区低甲基化(如5-AZAC)等。 p38MAPK信号通路在药物诱导γ珠蛋白基因表达中的重要作用 从1998年发现p38MAPK信号通路可以被造血因子激活并参与了EPO诱导的红系分化和血红蛋白合成之后,p38MAPK信号通路在γ珠蛋白基因表达中的重要作用也逐渐受到重视。研究显示p38MAPK信号通路参与了丁酸盐和丙戊酸诱导的HbF合成,并在HDAC抑制剂TSA、MS-275和scrptaid等诱导γ珠蛋白基因转录的过程中发挥重要作用。本课题组前期的研究结果也证明p38MAPK信号通路不仅参与了丁酸钠(sodium butyrate, NaB)和黄芪多糖诱导的K562细胞γ珠蛋白基因表达,而且p38持续磷酸化可以上调γ珠蛋白基因mRNA并增加HbF合成。上述结果提示p38MAPK信号通路激活可能是药物诱导Y珠蛋白表达的重要环节。 表观遗传修饰在p38MAPK信号通路诱导丫珠蛋白基因表达中的重要作用 本课题组前期通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)等方法,证明p38MAPK信号通路激活可提高γ珠蛋白基因启动子区组蛋白H3、H4乙酰化水平和组蛋白H3磷酸化水平,且该作用可被p38MAPK特异性抑制剂SB203580阻断,提示p38MAPK信号通路可通过介导γ珠蛋白基因启动子区表观遗传修饰调控Y珠蛋白基因表达。转录因子在p38MAPK信号通路诱导丫珠蛋白基因表达中的重要作用 本课题组通过建立p38高/低磷酸化的K562细胞模型,利用凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMS A)和super-EMSA实验对γ珠蛋白基因表达相关转录因子进行筛选,发现GATA结合蛋白1(GATA binding protein-1, GATA1)、cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element binding protein, CREB)和激活转录因子-2(ictivating transcription factor2, ATF-2)可与Gγ珠蛋白启动子区特异DNA序列结合,提示这三种转录因子可能参与了p38MAPK信号通路对γ珠蛋白基因的表达调控。Pace等已经证明HDAC抑制剂可以通过激活活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)诱导p38磷酸化,并由此激活下游的转录激活蛋白如CREB和ATF-2调控γ珠蛋白基因表达；但是作为红系特异转录因子的GATAl在p38MAPK信号通路调控Y珠蛋白基因表达中的作用尚未明确。GATA1对丫珠蛋白基因表达的作用 GATA1是GATA转录因子家族成员之一,其稳固结合位点广泛分布于珠蛋白基因和其他红系特异基因的启动子和增强子,可转录激活所有已知的红系特异基因,因此,被认为是红系造血的关键调节因子。GATA1高活性是珠蛋白基因表达和红细胞成熟必不可少的条件,培养人脐血CD36+细胞至第7天,GATA1mRNA比第四天上调,而p和γ珠蛋白mRNA在第7天和15天均比第4天上调,表明GATA1的表达峰在珠蛋白基因mRNA表达峰之前。另外,本课题组前期发现p38MAPK信号通路激活的同时GATA1磷酸化水平增加,且该现象可被p38特异抑制剂SB203580阻断,提示GATA1可能参与了p38MAPK信号通路对γ珠蛋白基因的表达调控,但是其明确作用及机制仍有待进一步验证和探讨。 因此,本研究首先建立了不同p38MAPK和GATA1状态的细胞模型,采用realtime RT-PCR和Western blotting方法分析GATA1在p38MAPK信号通路诱导Y珠蛋白基因表达过程中的变化和沉默GATA1基因对p38MAPK信号通路诱导丫珠蛋白基因表达的影响,从而验证GATA1在p38MAPK信号通路诱导丫珠蛋白基因表达中的作用；然后通过ChIP技术探讨GATA1对p38MAPK信号通路介导的表观遗传修饰调控γ珠蛋白基因表达的影响。研究结果不仅可以阐明GATA1在经p38MAPK信号通路介导的表观遗传修饰调控γ珠蛋白基因表达中的作用,为揭示药物诱导丫珠蛋白基因作用机制提供新的科学证据,而且可以为开发和设计治疗p-珠蛋白生成障碍性贫血的新药提供新的靶点。方法： 1.细胞株 本研究以人红白血病K562细胞为研究对象,设不表达GATA1基因和γ珠蛋白基因的人宫颈癌Hela细胞为对照。 2.细胞模型： 2.1p38高/低磷酸化K562细胞模型的建立、分组和命名：①稳定p38高磷酸化的K562细胞[K562-MKK3(Glu)细胞]；②稳定p38低磷酸化的K562细胞[K562-MKK3(Ala)细胞]；③载体对照(K562-pcDNA3.1细胞)④p38MAPK信号通路特异抑制剂SB203580预处理的K562-MKK3(Glu)细胞[K562-MKK3(Glu)+SB细胞1⑤0.5mM NaB处理48h的K562细胞[K562(NaB)细胞]；⑥SB203580预处理1h后再用0.5mM NaB处理48h的K562细胞[K562(NaB)+SB细胞]；⑦设立K562细胞对照；⑧设立Hela细胞对照。 2.2沉默GATAl基因的K562细胞模型的建立、分组和命名：根据shRNA设计原则设计1对64nt寡核苷酸,送公司合成并退火。采用分子克隆方法构建pSUPER-shRNA真核表达重组质粒并进行酶切和测序鉴定,以脂质体介导将pSUPER-shRNA重组质粒和pSUPER-EGFP空质粒分别转染对数生长期的K562细胞,经G418筛选和鉴定后,建立①转染pSUPER-shRNA重组质粒的K562细胞(K562-shRNA细胞)；②转染pSUPER-EGFP空质粒的K562细胞(K562-pSUPER细胞)；③转染pSUPER-shRNA重组质粒的K562(NaB)细胞[K562(NaB)-shRNA细胞]；④转染pSUPER-EGFP空质粒的K562(NaB)细胞[K562(NaB)-pSUPER细胞]；⑤设立K562细胞对照；⑥设立K562(NaB)细胞对照。 3. Real time RT-PCR和Western blotting:采用real time RT-PCR方法检测Aγ、Gγ珠蛋白基因和GATA1基因mRNA水平;采用Western blotting方法检测p38磷酸化(p-p38)、GATA1、GATA1磷酸化(p-GATA1)和HbF水平。 4.染色质免疫共沉淀：采用基于real time PCR分析的ChIP技术分析Aγ和Gγ珠蛋白基因启动子区GATA1结合水平(Aγ-GATA1和Gγ-GATA1)、组蛋白H3乙酰化(acetylated H3, acH3)水平(Aγ-acH3和Gγ-acH3)和组蛋白H3磷酸化水平(Aγ-ph/acH3和Gγ-ph/ac H3。) 5.统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示,误差线代表标准差。两样本比较采用配对样本t检验,多个样本均数的比较采用单向方差分析(one-way AN OVA)。根据方差齐性检验结果,如方差齐时多重比较采用LSD (Least-significant-Difference)方法检验；如方差不齐时方差分析采用近似F检验Welch法,多重比较采用Dunnett'sT3方法检验。检验水准为a=0.05。结果1.GATAl在p38MAPK信号通路诱导丫珠蛋白基因表达中的变化 1.1高/低磷酸化p38MAPKK562细胞p38磷酸化水平的变化 与K562-pcDNA3.1细胞和K562细胞相比,K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞p-p38水平分别升高了2.189倍和2.159倍(P≤0.026)；SB预处理之后,K562-MKK3(Glu)+SB细胞和K562(NaB)+SB细胞p-p38水平下降,分别为K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞的37.764%和56.461%(P≤0.030)；K562-MKK3(Ala)细胞p-p38水平下降,为K562-pcDNA3.1细胞的42.235%(P0.001)。K562-pcDNA3.1细胞与K562细胞p-p38水平之间的差异无统计学意义(P=0.997)。Hela细胞p-p38水平约为K562细胞的55.591%(P=0.083)。 1.2高/低磷酸化P38MAPKK562细胞GATA1mRNA水平 与K562-pcDNA3.1细胞和K562细胞相比,K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞GATA1mRNA水平分别增加1.565倍和1.533倍(P0.002); SB预处理之后,K562-MKK3(Glu)+SB细胞和K562(NaB)+SB细胞GATA1mRNA水平下降,分别为K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞的73.114%和50.209%(P0.009); K562-MKK3(AIa)细胞、K562-pcDNA3.1细胞和K562细胞GATA1mRNA水平之间的差异无统计学意义(P≥0.111)。Hela细胞中未检测到GATA1mRNA表达。1.3高/低磷酸化p38MAPKK562细胞GATAl表达及其磷酸化 与K562细胞相比,K562(NaB)细胞GATA1表达升高了1.532倍(P0.001)；K562细胞、K562-pcDNA3.1细胞、K562-MKK3(Glu)细胞、K562-MKK3(Ala)细胞、K562(NaB)+SB细胞和K562-MKK3(Glu)+SB细胞GATA1表达的差异无统计学意义(P≥0.055)。Hela细胞中未检测到GATAl表达。 与K562-pcDNA3.1细胞和K562细胞相比,K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞p-GATA1水平分别增加了2.066倍和1.532倍(P0.001)；K562-MKK3(Glu)+SB细胞和K562(NaB)+SB细胞p-GATA1水平下降,分别为K562-MKK3(G1u)细胞和K562(NaB)细胞的30.996%和38.802%(P0.001)。K562-MKK3(Ala)细胞p-GATA1水平下降,为K562-pcDNA3.1细胞的46.632%(P0.001)。K562-pcDNA3.1细胞与K562细胞p-GATAl水平之间的差异无统计学意义(P=0.077)。Hela细胞中未检测到p-GATAl表达。 1.4高/低磷酸化p38MAPKK562细胞Aγ和Gγ珠蛋白mRNA水平 与K562-pcDNA3.1细胞和K562细胞相比,K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞Aγ-mRNA水平分别增加1.399倍和1.777倍(P≤0.010)；SB预处理之后,K562-MKK3(Glu)+SB细胞和K562(NaB)+SB细胞Aγ-mRNA水平下降,分别为K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞的30.648%和49.599%(P≤0.010)；K562-MKK3(Ala)细胞Aγ-mRNA水平下降,为K562-pcDNA3.1细胞的38.925%(P=0.006)；K562-pcDNA3.1细胞与K562细胞Aγ-mRNA0水平之间的差异无统计学意义(P=0.999)。He1a细胞中未检钡到Aγ-mRNA表达。 与K562-pcDNA3.1细胞和K562细胞相比,K562-MKK3(G1u)细胞和K562(NaB)细胞Gγ-mRNA水平分别增加了1.770倍和2.088倍(P0.001)；SB预处理之后,K562-MKK3(Glu)+SB细胞和K562(NaB)+SB细胞Gγ-mRNA水平降低,分别为K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞的23.638%和77.756%(P0.001)；K562-MKK3(Ala)细胞Gγ-mRNA水平下降,为K562-pcDNA3.1细胞的37.996%(P0.001)；K562.pcDNA3.1细胞与K562细胞Gγ-mRNA水平之间的差异无统计学意义(P=0.596)。Hela细胞中未检测到Gγ-mRNA表达。1.5高/低磷酸化p38MAPKK562细胞HbF表达 与K562-pcDNA3.1细胞和K562细胞相比,K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞HbF表达分别增加了1.841倍和1.786倍(P0.001)；SB预处理之后,K562-MKK3(Glu)+SB细胞和K562(NaB)+SB细胞HbF表达下降,分别为K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞的51.515%和35.142%(P0.001)；K562-MKK3(Ala)细胞HbF表达下降,为K562-pcDNA3.1细胞的45.144%(P0.001)；K562-pcDNA3.1细胞与K562细胞HbF表达的差异无统计学意义(P=0.613).Hela细胞中未检测到HbF表达。 上述结果提示p38MAPK信号通路激活可诱导γ珠蛋白基因达,且GATA1mRNA和磷酸化水平的变化与p38磷酸化水平有关。2.沉默GATAl基因对NaB诱导的p38MAPK信号通路诱导丫珠蛋白基因表达的影响 2.1沉默GATA1基因对NaB诱导的p38高磷酸化细胞GATA1mRNA的影响 K562-shRNA细胞和K562(NaB)-shRNA细胞GATA1mRNA表达下降,分别为K562-pSUPER细胞和K562(NaB)-pSUPER细胞的47.904%和48.644%(P≤0.023)。 2.2沉默GATAl基因对NaB诱导的p38高磷酸化细胞GATAl表达及其磷酸化的影响 K562-shRNA细胞和K562(NaB)-shRNA细胞GATA1表达减少,分别为K562-pSUPER和K562(NaB)-pSUPER细胞的58.810%和32.522%(P0.001)。 K562-shRNA细胞和K562(NaB)-shRNA细胞中p-GATAl水平下降,分别为K562-pSUPER细胞和K562(NaB)-pSUPER细胞的59.792%和49.023%(P0.023)。 2.3沉默GATAl基因降低NaB诱导的p38高磷酸化K562细胞Aγ和Gγ珠蛋白mRNA水平 K562-shRNA细胞Aγ-mRNA水平为K562-pSUPER细胞的1.137倍,差异有统计学意义(P=0.009)但无实际意义；K562(NaB)-shRNA细胞Aγ-mRNA水平下降,为K562(NaB)-pSUPER细胞的50.599%(P0.001)。 K562-shRNA细胞和K562(NaB)-shRNA细胞Gy-mRNA水平下降,分别为K562-pSUPER细胞和K562(NaB)-pSUPER细胞的62.726%和36.035%(P0.001)。 2.4沉默GATAl基因减少NaB诱导的p38高磷酸化K562细胞中HbF合成 K562-shRNA和K562(NaB)-shRNA细胞HbF表达下降,分别为K562-pSUPER和K562(NaB)-pSUPER细胞的63.019%和80.332%(P≤0.001)。 上述结果说明沉默GATA1基因可下调NaB诱导的p38高磷酸化细胞GATA1mRNA水平、GATA1表达和磷酸化水平、γ珠蛋白mRNA水平和HbF合成,进一步提示GATA1在p38MAPK信号通路诱导的γ珠蛋白基因表达过程中发挥重要作用。 3GATAl在p38MAPK信号通路介导表观遗传修饰调控γ珠蛋白基因表达中的作用 3.1γ珠蛋白基因启动子区扩增片段的的%Input值 3.1.1Aγ珠蛋白基因启动子区GATA1的%Input值 与阴性对照IgG抗体相比,抗GATA1抗体ChIP后,K562(NaB)细胞Aγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值增高(t=7.282,P=0.018),K562细胞(t=2.567, P=0.124)、K562(NaB)+SB细胞(t=3.445,t=0.075)和K562(NaB)-shRNA细胞(t=4.193,P=0.052)抗GATA1抗体与阴性对照IgG抗体ChIP沉淀下来的Aγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值之间的差异无统计学意义,Hela细胞Aγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值低于阴性对照IgG(t=15.741,P=0.004)。 3.1.2Gγ珠蛋白基因启动子区GATAl的%Input值 与阴性对照IgG相比,抗GATA1抗体ChIP后K562细胞(t=17.312,P=0.003)和K562(NaB)细胞(t=7.895, P=0.016)Gγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值升高,K562(NaB)细胞Gγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值升高幅度最大,达到阴性对照IgG的2.828倍；K562(NaB)+SB细胞(t=0.068,P=0.952)和K562(NaB)-shRNA细胞(t=2.067,P=0.175)Gγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值与阴性对照IgG相比差异无统计学意义。Hela细胞Gγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值低于阴性对照IgG(t=21.840,P=0.002)。 3.1.3Aγ珠蛋白基因启动子区acH3的%Input值 与阴性对照IgG抗体相比,抗acH3抗体ChIP后K562细胞(t=15.412,P=0.004)和K562(NaB)细胞(t=9.295,P=0.011)Aγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值升高,K562(NaB)细胞Aγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值升高幅度达到阴性对照IgG抗体的7.372倍;K562(NaB)+SB细胞Aγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值降低(t=12.401,t=0.006); K562(NaB)-shRNA细胞抗acH3抗体和阴性对照IgG抗体ChIP后沉淀下来的Aγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值之间的差异无统计学意义(t=0.749,P=0.532)；Hela细胞抗acH3抗体沉淀后Aγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值低于阴性对照IgG(t=6.092,P=0.026)。 3.1.4Gγ珠蛋白基因启动子区acH3的%Input值 与阴性对照IgG抗体相比,抗acH3抗体ChIP后,K562细胞(t=8.474,P=0.014)和K562(NaB)细胞(t=10.320,P=0.009)Gγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值升高,K562(NaB)细胞Gγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值升高幅度达到阴性对照IgG的9.614倍；K562(NaB)+SB细胞(t=3.277,P=0.082)和K562(NaB)-shRNA细胞(t=0.478,P=0.680)抗acH3抗体和阴性对照IgG抗体ChIP后沉淀下来的Gγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值差异无统计学意义。Hela细胞Gγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值低于阴性对照IgG抗体(t=31.261,P=0.001)。 3.1.5Aγ珠蛋白基因启动子区ph/acH3的Input%值 与阴性对照IgG抗体相比,抗ph/acH3抗体ChIP后K562细胞(t=6.755,P=0.021)、K562(NaB)细胞(t=22.589, P=0.002)、K562(NaB)+SB细胞(t=4.778,P=0.041)和K562(NaB)-shRNA细胞(t=10.333,P=0.009)Aγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值升高；Hela细胞抗ph/acH3抗体和阴性对照IgG抗体ChIP后沉淀下来的Aγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值之间的差异无统计学意义(t=2.090,P=0.172)。 3.1.6Gγ珠蛋白基因启动子区ph/acH3的Input%值 与阴性对照IgG抗体相比,抗ph/acH3抗体ChIP后,K562细胞(t=10.130,P=0.010)、K562(NaB)细胞(t=23.144, P=0.002)和K562(NaB)-shRNA细胞(t=15.524, P=0.004) Gγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值升高,K562(NaB)细胞Gγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值升高幅度达到阴性对照IgG的49.092倍；K562(NaB)+SB细胞抗ph/acH3抗体和阴性对照IgG抗体ChIP后沉淀下来的Gγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值差异无统计学意义(t=4.263,P=0.051)。Hela细胞Gγ珠蛋白基因启动子区扩增片段的%Input值低于阴性对照IgG抗体(t=6.465,P=0.023)。 3.2NaB激活p38MAPK信号通路诱导γ珠蛋白基因表达过程中丫珠蛋白基因启动子区GATAl相对水平和表观遗传修饰的变化 3.2.1NaB激活p38MAPK信号通路增加K562细胞Aγ和Gγ珠蛋白基因启动子区GATAl相对水平 与K562细胞相比,K562(NaB)细胞Ay-GATA1和Gy-GATA1水平升高,分别为K562细胞的1.740倍和1.721倍(P≤0.004)；SB预处理之后,K562(NaB)+SB细胞的Aγ-GATA1和Gγ-GATA1水平下降,分别为K562(NaB)细胞的26.064%和33.823%(P≤0.001)。3.2.2NaB激活p38MAPK信号通路增加K562细胞Aγ和Gγ珠蛋白基因启动子区组蛋白H3乙酰化水平 与K562细胞相比,K562(NaB)细胞Ay-acH3和Gy-acH3水平升高,分别为K562细胞的3.049倍和4.960倍(P≤0.017)；SB预处理之后,K562(NaB)+SB细胞Ay-acH3和Gy-acH3水平下降,分别为K562(NaB)细胞的2.248%和0.584%(P≤0.011)。 3.2.3NaB激活p38ME APK信号通路增加K562细胞Aγ和Gγ珠蛋白基因启动子区组蛋白H3磷酸化水平 与K562细胞相比,K562(NaB)细胞Ay-ph/acH3和Gy-ph/acH3水平升高,分别为K562细胞的8.639倍和19.456倍(P≤0.004)；SB预处理之后,K562(NaB)+SB细胞Aγ-ph/acH3和Gγph/acH3水平下降,分别为K562(NaB)细胞的12.324%和6.433%(P≤0.004)。 3.3沉默GATAl基因对NaB激活p38MAPK信号通路介导表观遗传修饰的影响 3.3.1沉默GATAl基因对NaB诱导的p38高磷酸化K562细胞Aγ和Gγ珠蛋白基因启动子区GATAl相对水平的影响 K562(NaB)-shRNA细胞Aγ-GATA1和Gγ-GATA1水平下降,分别为K562(NaB)细胞的17.846%和18.457%(P0.001)。 3.3.2沉默GATAl基因对NaB诱导的p38高磷酸化K562细胞Aγ和Gγ珠蛋白基因启动子区acH3相对水平的影响 K562(NaB)-shRNA细胞Aγ-acH3和Gγ-acH3水平下降,分别为K562(NaB)细胞的14.845%和11.213%(P0.008)。3.3.3沉默GATAl基因对NaB诱导的p38高磷酸化K562细胞Aγ和Gγ珠蛋白基因启动子区ph/acH3相对水平的影响 K562(NaB)-shRNA细胞Aγ-ph/acH3和Aγ-ph/acH3水平下降,分别为K562(NaB)细胞的18.100%和9.584%(P≤0.003) 上述结果提示GATA1在p38MAPK信号通路介导的表观遗传修饰调控γ珠蛋白基因表达过程中起重要作用。 结论 1.研究证明在p38高磷酸化的K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞中,GATA1mRNA上调,GATA1磷酸化增强,γ珠蛋白基因mRNA上调,HbF合成增加,K562(NaB)细胞GATA1表达增加；在p38低磷酸化的K562-MKK3(Ala)细胞中,GATA1磷酸化减弱,Y珠蛋白基因mRNA下调,HbF合成减少；与K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞相比,K562-MKK3(Glu)+SB细胞和K562(NaB)+SB细胞GATA1mRNA下调,GATA1磷酸化减弱,γ珠蛋白基因mRNA下调,HbF合成减少。进一步证明GATA1表达的变化与p38磷酸化水平有关。 2.首次实验证明沉默GATA1基因可使NaB诱导的p38高磷酸化细胞GATA1mRNA和丫珠蛋白mRNA下调,GATA1表达减少和磷酸化减弱,HbF合成减少,提示GATAl在p38MAPK信号通路诱导的Y珠蛋白基因表达中发挥重要作用。 3.首次实验证明沉默GATA1基因之后,NaB激活p38MAPK信号通路诱导Y珠蛋白基因表达时,Y珠蛋白基因启动子区GATA1结合水平下降,组蛋白H3乙酰化减弱,组蛋白H3磷酸化减弱,Y珠蛋白基因表达下降,HbF合成减少。提示GATAl在p38MAPK信号通路介导表观遗传修饰调控丫珠蛋白基因表达中发挥重要作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R725.5

【参考文献】

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本文编号：2476269