Sedlin蛋白对人软骨细胞增殖的影响及作用机制

发布时间：2019-09-18 23:28

【摘要】：第一部分靶向增强、干扰人软骨细胞SEDL基因，，基因芯片检测细胞内骨发育相关基因表达变化 目的：靶向增强或者干扰人软骨细胞SEDL基因，骨再生PCR芯片检测细胞内骨发育相关基因表达变化，为进一步研究SEDT发病机制提供高通量信息。 方法：采用定向克隆及大肠杆菌内同源重组的方法分别构建靶向增强SEDL的腺病毒质粒pAd5-SEDL和靶向干扰SEDL的慢病毒质粒LV-siSEDL，分别导入293T细胞包装成重组腺病毒pAd5-SEDL和重组慢病毒LV-siSEDL，酶切鉴定（课题组前期已完成）。HEK293细胞扩增重组腺病毒，收集病毒液，检测病毒滴度。将重组腺病毒、重组慢病毒以最适感染复数（Multiplicity of infection，MOI）分别感染HC-a，实验分4组：增强组（HC-a/pAd5-SEDL）、增强阴性对照组（HC-a/pAd5空载体）、干扰组(HC-a/LV-siSEDL)、干扰组阴性对照组（HC-a/LV空载体），收集4组细胞mRNA进行骨再生PCR芯片检测。 结果：1、收获高滴度重组腺病毒pAd5-SEDL，病毒滴度为2.6×1011pfu/ml。 2、重组腺病毒和重组慢病毒成功感染HC-a，重组腺病毒对HC-a的MOI值为50，重组慢病毒对HC-a的MOI值为20。 3、基因芯片结果：SEDL基因表达改变导致其上下游基因表达发生变化，其中与软骨生长发育密切相关的基因有：COL2A、CD36、FLT1、GDF10、IGF1等。 结论：SEDL基因与骨发育相关，软骨细胞内SEDL基因表达变化引起细胞内与骨发育相关的基因表达改变，如COL2A等。 第二部分Sedlin蛋白对人软骨细胞增殖的影响及作用机制初步研究 目的:结合基因芯片筛选出来的差异基因，探索Sedlin蛋白对人软骨细胞增殖的影响及作用机制，进一步探索X-连锁迟发型脊柱骨骺发育不良的发病机制。 方法:实验分为增强组（感染pAd5-SEDL的HC-a）、干扰组（感染LV-SEDLsi的HC-a）、空白对照组（HC-a）。应用MTT法检测三组HC-a的增殖活性；QPCR检测三组HC-a中SEDL基因和COL2A基因mRNA表达；Western blot检测三组HC-a中sedlin蛋白表达；细胞免疫组化检测三组HC-a Ⅱ型胶原蛋白表达。 结果:1、与空白对照组相比，增强组HC-a细胞增殖活性增高，干扰组细胞增殖受到明显抑制（P0.05）。 2、QPCR结果显示增强组HC-a SEDL基因表达量最高，空白对照组其次，干扰组HC-a表达量明显降低（P0.001）。三组细胞COL2AmRNA表达量中，增强组明显高于空白对照组和干扰组，干扰组表达量最低（P0.001）。 3、三组HC-a中，增强组sedlin蛋白表达最高，其次为空白对照组，干扰组表达量最低（P0.001）。 4、免疫组化结果显示三组HC-a中，增强组Ⅱ型胶原蛋白的表达量最高，空白对照组其次，干扰组HC-a内几乎不表达Ⅱ型胶原蛋白（P0.001）。 结论:SEDL通过调节Ⅱ型胶原蛋白的表达影响人软骨细胞增殖。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R726.8

【参考文献】

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1 郭洪;章波;许雪青;王燕;白云;;土家族迟发性脊椎骨骺发育不良一家系报告[J];第三军医大学学报;2007年02期

2 吴明煜,郭晓红,王万贤,柯文山,杨毅,吴燕;生物芯片研究现状及应用前景[J];科学技术与工程;2005年07期

3 王升启;基因芯片技术及应用研究进展[J];生物工程进展;1999年04期

4 高超,罗强,王怀立,高晓群,范清堂,王华,盛光耀,周建华,高铁铮;X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系SEDL基因突变研究[J];中华医学遗传学杂志;2003年01期

5 麻宏伟,姜俊,吕峻峰,郭然,牛国辉;X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良SEDL基因剪接受体突变导致潜在剪接位点激活(英文)[J];中华医学遗传学杂志;2005年03期

6 于凤池;;基因芯片技术及其在植物研究中的应用[J];中国农学通报;2009年06期

本文编号：2537774