新一代测序技术确诊1例遗传多囊肾病家系
发布时间：2019-09-30 06:58
【摘要】：目的明确1例肝肾发育异常患儿的遗传学病因。方法收集该患儿的家族史及临床资料,抽取患儿及其父母外周静脉血2 mL,对患儿基因组DNA进行新一代测序分析,并对疑似致病性突变位点进行Sanger测序验证及生物信息学预测。结果该患儿系第三胎第一产,前2胎均在围产期死亡,B超示多囊肾表现。该患儿为男性,4月大,腹部膨隆可触及质硬包块,腹部超声提示多囊肾并肝纤维化,新一代测序显示患儿PKHD1基因第30外显子c.3500TC(p.L1167P)杂合突变,遗传自母亲;另外患儿PKHD1基因第58外显子c.9235_9236del GCins AA(p.A3079K)杂合突变,来自父亲;父母表型均正常,这2个突变均为新发现的突变。结论该患儿是由PKHD1基因的复合杂合突变导致的常染色体隐性遗传多囊肾病(ARPKD),结合家族史推断,该家系前2胎可能同样患有ARPKD。新一代测序可对该类疾病明确诊断,并有助于遗传咨询,以避免该类悲剧的再次发生。
【图文】：
?20~30g/L),前白蛋白56.5g/L(参考范围:125~200g/L),余正常。1.1.3影像学检查腹部B超显示双肾形态失常,体积明显增大,右肾大小约12.3cm×6.2cm,左肾大小约10.5cm×5.6cm,实质回声增强,皮髓质分界不清。双肾实质内弥漫分布细小囊腔,部分囊腔内可见小强回声光点,后方伴彗星尾征。肝脏大小可,内回声增强、粗糙,可见细小网格样回声。门静脉主干内径约0.5cm。肝内管道略扩张,宽约0.14cm,肝内血管略显迂曲。肝门区探及一范围约3.1cm×1.1cm的囊性包块,壁薄清晰,内透声可。超声提示:双肾婴儿型多囊肾合并肝纤维化;胆总管囊肿(图1)。患儿出生后23d,曾因黄疸在外院行血液肝功能检查,示总胆红素230μmol/L,直接胆红素17μmol/L。腹部超声检查提示:胆囊沉积物;胆总管囊肿;经内科治疗好转后出院。1.2方法1.2.1样本采集与DNA提取经本院伦理委员会讨论通过,与患儿父母签署知情同意书后,抽取患儿及父母外周静脉血各2mL,置于EDTA抗凝管中,以天根血液基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取样本DNA。1.2.2二代测序首先构建基因组文库,然后通过探针杂交捕获与多囊肾相关基因的外显子及相邻内含子区域(±50bp),并进行富集(由北京信诺佰世医学检验所完成)。探针杂交捕获的具体方法如下:将500ngDNA文库与PreparationofSureSelectBlockMix缓冲液和设计的探针混合,95℃加热5min,65℃加热至少5min,加入20μL预热至65℃的Cap-tureLibraryHybridizationMix缓冲液,上下吹吸10次,在热循环仪上使用热盖105℃,每个杂交反应加入30μLMyOneStreptavidinT1magneticbeads磁珠,65℃杂交16~24h。清洗磁珠,向磁珠中加入100μLSureSelectBindingBuffer清洗3次,最后用100μLSureSelectBindingBuffer重悬磁珠。将杂交反应体系转移至含有100μL磁珠的试管中,
-660-中华生殖与避孕杂志2017年8月第37卷第8期ChinJReprodContracep,August2017,Vol.37,No.8分析预测。2结果2.1新一代测序与Sanger测序验证患儿PKHD1基因存在2个位点突变,分别是c.3500T>C(p.L1167P)杂合突变和c.9235_9236delGCinsAA(p.A3079K)杂合突变(图2)。Sanger测序验证显示,c.3500T>C(p.L1167P)杂合突变来自母亲(图3A,3C),c.9235_9236delGCinsAA(p.A3079K)杂合突变来自父亲(图3B,3D),患儿父母为突变携带者,这2个突变均为新发现的突变。2.2生物信息软件致病性分析结果对c.3500T>C(p.L1167P)和c.9235_9236delGCinsAA(p.A3079K)突变进行预测,SIFT和MutationTaster均预测为有害突变。采用ExPASY系统中的部分功能,预测突变蛋白结构变化显示,2种突变均使PKHD1基因所编码的蛋白质二级结构发生了变化,这些都可能最终导致蛋白质功能的改变,详见因突变位点序列设计引物,并对患儿及其父母目标序列进行Sanger测序,分析测序结果。1.2.4突变位点致病性预测分析采用多种生物学软件如SIFT、MutationTaster以及ExPASY系统,对测序结果进行表1二代测序参数表测序深度10×以上20×以上30×以上目标基因覆盖度99.216%98.612%97.570%平均测序深度170.68×表2Sanger测序引物序列表PKHD1基因突变引物序列p.L1167Pp.A3079K上游下游上游下游CCAATATGTGGTGCTCTTTGCTGGCTTCTGTGAGGTACTGGATGTGGCAGACTCTTCAGACTGCACATGCCAATACTCAGCAGGTTGGACAGCA:PKHD1基因c.3500T>C(p.L1167P)杂合突变;B:PKHD1基因c.9235_9236delGCinsAA(p.A3079K)杂合突变图2患儿PKHD1基因新一代测序截屏图
【作者单位】： 山东大学齐鲁儿童医院儿科研究所;山东大学齐鲁儿童医院肾脏免疫科;
【分类号】：R726.9
本文编号：2544154
【图文】：
?20~30g/L),前白蛋白56.5g/L(参考范围:125~200g/L),余正常。1.1.3影像学检查腹部B超显示双肾形态失常,体积明显增大,右肾大小约12.3cm×6.2cm,左肾大小约10.5cm×5.6cm,实质回声增强,皮髓质分界不清。双肾实质内弥漫分布细小囊腔,部分囊腔内可见小强回声光点,后方伴彗星尾征。肝脏大小可,内回声增强、粗糙,可见细小网格样回声。门静脉主干内径约0.5cm。肝内管道略扩张,宽约0.14cm,肝内血管略显迂曲。肝门区探及一范围约3.1cm×1.1cm的囊性包块,壁薄清晰,内透声可。超声提示:双肾婴儿型多囊肾合并肝纤维化;胆总管囊肿(图1)。患儿出生后23d,曾因黄疸在外院行血液肝功能检查,示总胆红素230μmol/L,直接胆红素17μmol/L。腹部超声检查提示:胆囊沉积物;胆总管囊肿;经内科治疗好转后出院。1.2方法1.2.1样本采集与DNA提取经本院伦理委员会讨论通过,与患儿父母签署知情同意书后,抽取患儿及父母外周静脉血各2mL,置于EDTA抗凝管中,以天根血液基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取样本DNA。1.2.2二代测序首先构建基因组文库,然后通过探针杂交捕获与多囊肾相关基因的外显子及相邻内含子区域(±50bp),并进行富集(由北京信诺佰世医学检验所完成)。探针杂交捕获的具体方法如下:将500ngDNA文库与PreparationofSureSelectBlockMix缓冲液和设计的探针混合,95℃加热5min,65℃加热至少5min,加入20μL预热至65℃的Cap-tureLibraryHybridizationMix缓冲液,上下吹吸10次,在热循环仪上使用热盖105℃,每个杂交反应加入30μLMyOneStreptavidinT1magneticbeads磁珠,65℃杂交16~24h。清洗磁珠,向磁珠中加入100μLSureSelectBindingBuffer清洗3次,最后用100μLSureSelectBindingBuffer重悬磁珠。将杂交反应体系转移至含有100μL磁珠的试管中,
-660-中华生殖与避孕杂志2017年8月第37卷第8期ChinJReprodContracep,August2017,Vol.37,No.8分析预测。2结果2.1新一代测序与Sanger测序验证患儿PKHD1基因存在2个位点突变,分别是c.3500T>C(p.L1167P)杂合突变和c.9235_9236delGCinsAA(p.A3079K)杂合突变(图2)。Sanger测序验证显示,c.3500T>C(p.L1167P)杂合突变来自母亲(图3A,3C),c.9235_9236delGCinsAA(p.A3079K)杂合突变来自父亲(图3B,3D),患儿父母为突变携带者,这2个突变均为新发现的突变。2.2生物信息软件致病性分析结果对c.3500T>C(p.L1167P)和c.9235_9236delGCinsAA(p.A3079K)突变进行预测,SIFT和MutationTaster均预测为有害突变。采用ExPASY系统中的部分功能,预测突变蛋白结构变化显示,2种突变均使PKHD1基因所编码的蛋白质二级结构发生了变化,这些都可能最终导致蛋白质功能的改变,详见因突变位点序列设计引物,并对患儿及其父母目标序列进行Sanger测序,分析测序结果。1.2.4突变位点致病性预测分析采用多种生物学软件如SIFT、MutationTaster以及ExPASY系统,对测序结果进行表1二代测序参数表测序深度10×以上20×以上30×以上目标基因覆盖度99.216%98.612%97.570%平均测序深度170.68×表2Sanger测序引物序列表PKHD1基因突变引物序列p.L1167Pp.A3079K上游下游上游下游CCAATATGTGGTGCTCTTTGCTGGCTTCTGTGAGGTACTGGATGTGGCAGACTCTTCAGACTGCACATGCCAATACTCAGCAGGTTGGACAGCA:PKHD1基因c.3500T>C(p.L1167P)杂合突变;B:PKHD1基因c.9235_9236delGCinsAA(p.A3079K)杂合突变图2患儿PKHD1基因新一代测序截屏图
【作者单位】： 山东大学齐鲁儿童医院儿科研究所;山东大学齐鲁儿童医院肾脏免疫科;
【分类号】：R726.9
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1 刘淑平;丁洁;王芳;张琰琴;;常染色体隐性遗传性多囊肾PKHD1基因突变的研究[A];中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编（上册）[C];2012年
，本文编号：2544154
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/eklw/2544154.html
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