过敏性紫癜患儿外周血Midkine的表达及相关机制的探讨

发布时间：2020-01-21 12:47

【摘要】：研究背景：过敏性紫癜(Henoch-Sch(?)nlein purpura, HSP)是儿童期常见的全身性小血管炎性疾病,主要病理特点是以IgA为主的免疫复合物在微动脉、微静脉、毛细血管壁和肾小球系膜区的沉积。临床上主要表现为非血小板减少性的皮肤紫癜,关节痛、关节炎,腹痛、消化道出血,血尿、蛋白尿等,此外,还可能累计肺脏、肝脏、大脑和阴囊等。肠穿孔和中枢神经系统受累比较少见,但是HSP患者死亡的主要原因。HSP是一种特征性自限性疾病,但容易反复发作,影响其预后的主要因素是肾脏损伤程度,有的甚至发展为慢性肾功能衰竭。其病因及发病机制仍未完全明确,临床上仍缺乏诊断HSP的特异性实验室指标以及肾脏累及的早期预测指标,诊断一般根据临床表现、体征和组织病理学检查。研究表明,感染、药物、疫苗、环境以及自身免疫功能紊乱都可能导致HSP的发病。因此,通常认为HSP是一种环境因素,尤其是感染因素作用于具有遗传背景的个体,导致机体免疫应答异常,辅助性T淋巴细胞和B淋巴细胞活性增强,所引起的以IgA为主的免疫复合物所介导的系统性免疫性血管炎。该过程中,存在有细胞因子异常分泌,凝血和纤溶系统失调,炎性细胞浸润,IgA和补体等免疫复合物的沉积等。进一步研究HSP发病机制,寻找其特异性实验室诊断指标,早期预警肾脏累及,根治该疾病,是临床和科研工作者面临的重要任务。最近几年,临床和科研工作者结合临床流行病资料,利用先进的分子生物学技术,从分子和基因水平进一步研究了HSP的发病机制,取得了一定的研究成果。但对于HSP患儿细胞因子表达水平和免疫功能等方面的研究结果并不一致,而且仍有许多问题有待进一步研究和解决。中期因子(midkine, MK)是上世纪80年代发现的一种新的胚胎发育相关分子,又称为神经轴突促进生长因子-2,与多向性因子(pleiotrophin, PTN)共同组成肝素结合生长因子家族。最初以为MK在成年生物体内表达水平极低,并仅限于个别器官。但新近研究发现,MK在许多肿瘤疾病(如Wilms瘤、胃癌、胰腺癌、肝细胞癌、食管癌、乳腺癌、白血病等)、慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病(如克罗恩病、类风湿性关节炎、慢性肾炎、多发性硬化等)和组织修复过程中存在过表达或高表达。并且具有促进肿瘤发生发展、侵袭、促进血管生成、促有丝分裂、抗凋亡、促进炎症细胞趋化和纤维蛋白溶解等功能。同时,MK具有抗菌活性,能够抑制调节性T细胞(T-regulatory cell, Treg),诱导炎性细胞因子表达。一系列研究证明,外周血MK有可能成为一个敏感且有意义的疾病标志物,尤其是肿瘤性疾病和自身免疫性疾病,且其表达水平与病情轻重、是否伴有并发症以及预后紧密相关。本研究以检测HSP患儿外周血MK的表达为基础,探讨HSP患儿急性期免疫功能状态和细胞因子水平变化,为进一步明确HSP发病机制、寻找HSP特异性诊断指标奠定理论基础。目的：本实验旨在研究HSP患儿急性期外周血MK、免疫球蛋白、T细胞亚群和部分细胞因子的表达情况。分析MK与TNF、IFN-γ、IL-2、IL4、IL6、IL10和IL17A等细胞因子、免疫指标和实验室检查的相关性。探讨MK对HSP患儿病情的诊断和指导作用,以及MK是否能够早期预测HSP患儿的肾脏损害。同时,对肾脏累及组和无肾脏累及组HSP患儿补体、肌酐、尿素等生物学指标进行检测并做统计学分析,以期寻找HSP患儿肾脏损害的早期预测指标。方法：收集2015年在山东大学齐鲁儿童医院肾脏与风湿免疫科住院治疗的HSP患儿203例,从中选取符合入组标准的92例患儿进行研究。其中,紫癜性肾炎(Henoch-Sch(?)nlein purpura nephritis, HSPN)患儿36例,无肾脏损害HSP(HSP/no-nephritis)患儿56例。同时选取60名健康儿童为对照(normal controls, NC)。收集研究对象的空腹外周血,酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测各组研究对象血清中MK的表达水平；微量样本多重蛋白定量实验(Cytometric Bead Array, CBA)检测各组研究对象血清中TNF、IFN-γ、IL-2、IL4、IL6、IL10和IL17A的表达水平；免疫比浊法(Turbidimetric inhibition immuno assay)检测患儿免疫球蛋白；流式细胞术检测患儿T淋巴细胞亚群；并结合相关临床实验室检查,如尿微量白蛋白、24小时尿蛋白定量、尿蛋白比肌酐、补体C3、补体C4、D二聚体等,初步分析MK在HSP急性期患儿疾病发生发展过程中的作用。数据统计学分析采用IBM SPSS 23.0软件,双侧P0.05被认为具有统计学意义。对于连续性变量,根据数据特点采用T检验、方差分析检验、Kruskal-Wallis H检验、Mann-Whitney U检验；分类变量的比较采用χ2检验；各检测指标之间的相关性分析采用Spearman相关分析,并采用多重相关分析的Bonferroni校正；MK对于HSP的诊断能力评估采用受试者工作特征(receiver operating characteristics, ROC)曲线分析。ROC曲线下面积(area under the curve, AUC)为1.0时表示完美的诊断价值,AUC小于0.5为无诊断价值,0.5-0.7为较低诊断价值,0.7-0.9为有一定诊断价值,0.9-1.0为较强诊断价值。另外,计算其敏感度(sensitivity)、特异度(specificity)、临界浓度(cutoff concentration)和置信区间(confidence interval, CI)。结果：1、92例HSP患儿中,男孩56例(60.87%),女孩36例(39.13%)年龄6.76±2.04岁；60例NC组儿童中,男孩42例(70%),女孩18例(30%),年龄7.01±1.79岁。病例组与健康对照组儿童在性别和年龄组成上无统计学差异(P0.05)。92例患儿中,HSP/no-nephritis患儿56例,男孩32例(57.14%),女孩24例(42.86%),年龄6.46±2.12岁；HSPN患儿36例,男孩24例(66.67%),女孩12例(33.33%),年龄7.22±1.83岁。三组儿童在性别和年龄组成上也无统计学差异(P0.05)。其中,临床表现为单纯皮疹型的14例,男孩7例(50%),女孩7例(50%)；腹型15例,男孩9例(60%),女孩6例(40%)；关节型24例,男孩14例(58.33%),女孩10例(41.67%)；肾型13例,男孩11例(84.62%),女孩2例(15.38%)；混合型26例,男孩15例(57.69%),女孩11例(42.31%)2、HSP患儿外周血MK浓度为291.74 (248.56-396.42) pg/ml,明显高于健康对照组217.3 (198.98-243.65) pg/ml,(P0.05)。其中,HSPN组MK浓度为326.58 (266.58-459.25) pg/ml, HSP/no-nephritis组为280.72(233.67-384.36) pg/ml,均显著高于健康对照组(P0.05),而且,HSPN组MK浓度也高于HSP/no-nephritis组(P0.05)。3、HSP患儿外周血TNF、IFN-γ、IL4、IL6、和IL17A表达较健康对照组升高,IL10较健康对照组降低,而IL-2水平与健康对照组相比无差异。HSP/no-nephritis组与HSPN组患儿血清中以上检测的细胞因子水平均无统计学差异。4、HSP急性期患儿免疫功能各检测指标结果的统计学分析。(1)T淋巴细胞亚群分析：与健康对照组相比,HSP患儿外周血CD4+T淋巴细胞百分率和CD4+/CD8+比值下降(P0.01),CD8+T淋巴细胞百分率无统计学差异(P0.05)；CD4+、CD8+百分率以及CD4+/CD8+比值在HSPN组和HSP/no-nephritis组无统计学差异(P均0.05)。(2)免疫球蛋白分析：与健康对照组相比,HSP患儿外周血IgA、IgM、 IgE水平显著升高(P0.01),而IgG水平无明显差异(P0.05);IgA、 IgM、IgE水平在HSPN组和HSP/no-nephritis组无统计学差异(P均0.05),而IgG水平在HSPN组低于HSP/no-nephritis组(P=0.04)。(3)其他实验室检测指标：与健康对照组相比,HSP患儿外周血D二聚体水平显著升高(P=0.002),纤维蛋白原也显著增高(P0.01)。补体C3、补体C4、血尿素氮和血肌酐水平无统计学差异(P均0.05)；D二聚体、补体C3、补体C4、血尿素氮和血肌酐水平在HSPN组和HSP/no-nephritis组无统计学差异(P均0.05),HSPN组纤维蛋白原也高于HSP/no-nephritis组(P=0.02)。5、外周血MK浓度与HSP患儿临床特点的相关性分析。相关分析结果示：外周血MK与IL-4、IL-6,、L17A、IgA和IgE呈正相关；HSPN亚组,外周血MK与HSPN患儿血肌酐、尿微量白蛋白、24小时尿蛋白定量和尿蛋白比肌酐呈正相关。6、血清MK ROC曲线下面积是0.902,95%置信区间为0.841-0.963(P0.001)。外周血清MK对HSPN的诊断最佳临界值是295.58pg/ml,其敏感度为80.6%,特异性为88.3%。即当外周血清MK浓度大于295.58pg/ml时,HSP患儿可能出现肾脏累及。结论：1、MK在过敏性紫癜患儿,尤其是紫癜性肾炎患儿外周血中明显升高。2、进一步证实过敏性紫癜急性期患儿体内存在细胞免疫和体液免疫功能紊乱,以及炎症细胞因子分泌的紊乱和凝血功能紊乱。3、过敏性紫癜患儿外周血升高的MK与机体内IL-4、IL-6、L17A、IgA和IgE水平呈正相关,而且在HSPN患儿,MK与血肌酐、尿微量白蛋白、24小时尿蛋白定量和尿蛋白比肌酐呈正相关。4、本研究提示,MK在HSP的发病中可能具有重要作用,尤其是在紫癜肾的发生发展过程中。MK不仅有望成为HSP诊断的生物学指标,而且有可能是HSP患儿合并HSPN的早期预测指标。
【图文】：

标本,技术检测,细胞因子,多重

ａ：标准１；邋ｂ：标准１０；邋Ｃ：邋１３５号标本；ｄ：邋３号标本逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｑｕａｎｔｋａｔｉｖｅ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏ打邋ｏｆ邋ｃｙｌ：ｏｋｉｎｅｓ邋ｂｙ邋Ｃｊｔｏｍｅｔｒｉｃ邋Ｂｅａｄ邋Ａｒｒａｙ逡逑ａ：邋ｓ化ｎｄａｒｄ邋１；邋ｂ：邋ｓ化ｎｄａｒｄ邋１０；邋ｃ：邋ｓｐｅｃｉｍｅｎ邋１３５邋ｄ：邋ｓｐｅｃｉｍｅｎ邋３逡逑

图２邋９２例患儿临床表现分型逡逑Ｆｉｇ．２邋ＣＵｉｉｉｃａｌ邋ｃｌａｓｓｉ行ｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋９２邋ｃａｓｅｓ邋ｏｆ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ逡逑ＭＯＣ－逦＊＊逦５ＪＪ０－逡逑．…逦。＂逡逑。幻逦＊00？逡逑４逦…？’；；逦Ｔ逡逑？？逦Ｏ逦８：逡逑１ＳＣＣ－逦Ｏ逦？Ｍ逡逑１邋Ｔ邋＾逦１邋媤…ｉ邋１邋ｉ逡逑，…子Ｔ邋Ｔ逦－邋ｇ邋ｇ申逡逑ｃｃ－逦１＿Ｄ0－逡逑ＨＳＰＮ逦ＨＳＰ逦ＮＣ逦ｍ５逦ｔＫ逡逑ｗｍ逦巧巧逡逑８００００－逡逑？０００９－逡逑宣N逦Ｔ逡逑占逡逑，００邋的－逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R725.5

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