Npc1基因突变对小鼠肝功能及其肝脏中Telocytes生物学活性的影响

发布时间：2020-03-21 22:10

【摘要】：背景尼曼-匹克病(NPC1)是一种呈进行性加重的疾病,新生儿时期往往会出现淤胆,逐步表现为肝脾肿大,其中患者出现肝肿大症状的比例约为31%。Npc1~(-/-)小鼠与人类的发病过程及临床表现非常的相似,早期出现肝脾肿大以及肝功能异常,如碱性磷酸酶及转氨酶均显著高于Npc1~(+/+)小鼠。由于肝脏细胞内脂类的异常聚集引发炎症细胞浸润以及肝细胞功能下降,最终导致肝脏细胞出现早期凋亡甚至纤维化的发生。近年来,随着对Telocytes(TCs)研究的不断深入,发现其在维持组织稳态和调节组织器官发育和免疫监视方面发挥着关键作用。目前,肝脏中TCs的存在已获得证实,但对TCs的研究大多聚焦在形态学研究方面,而关于Npc1基因突变后对肝脏中TCs的形态及其功能研究鲜有报道。因此,本课题以Npc1~(-/-)小鼠(BALB/cNctr-Npc1~(m1N)/J)为实验动物模型,首先明确Npc1基因突变对晚期小鼠肝脏功能及病理变化影响,随后检测Npc1基因突变对TCs的形态学及其多向分化潜能的影响,上述研究结果为进一步深入研究Npc1基因突变所导致的TCs生物学活性变化与肝功能异常之间的相互作用机制提供理论支持。目的明确Npc1基因突变对晚期小鼠肝功能及病理变化影响,并进一步研究Npc1基因对肝脏中TCs的生物学活性影响,为深入研究TCs生物学活性与肝功能之间的相互作用机制提供理论支持。方法1.通过PCR法对小鼠进行基因型鉴定。2.眼内眦取血检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性变化。3.取肝组织进行石蜡和冷冻切片,通过HE染色和油红O染色评估肝脏组织的形态变化和脂肪储存情况,以及Masson染色评估肝脏组织胶原沉积情况。4.Real-time PCR和Western blotting分别检测肝脏组织促炎症因子,白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的mRNA和蛋白水平表达情况;TUNEL染色评估肝脏组织凋亡情况。5.透射电镜(TEM)和细胞免疫荧光染色对TCs进行细胞鉴定。6.改进型II型胶原酶消化法提取并培养新生Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)小鼠肝脏原代TCs,利用细胞差速贴壁法对提取的TCs进行纯化。定时在倒置显微镜下观察Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)组中TCs的生长状态,并记录正常生长状态下TCs的形态;通过扫描电镜(SEM)观察TCs的形态。7.通过成脂诱导液、成骨诱导液和成心肌诱导液分别对Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)组新生小鼠肝脏TCs诱导培养,并用油红O染色、茜素红染色和细胞免疫荧光对诱导后的肝脏TCs进行鉴定。结果1.基因鉴定筛选出新生的Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)小鼠。2.与晚期(P60)Npc1~(+/+)小鼠相比,Npc1~(-/-)小鼠的体重及肝脏系数显著降低(P0.001);LDH、ALT及AST活性显著升高(P0.001)。3.HE染色发现,Npc1~(-/-)小鼠肝脏组织形态改变明显,出现大量泡沫细胞;油红O染色显示,Npc1~(-/-)小鼠肝脏脂肪含量显著降低。4.Real-time PCR显示,Npc1~(-/-)小鼠肝脏组织IL-1β、IL-6和TNF-α表达均显著升高(P0.01,P0.05和P0.001),同时,Western blotting也显示,三个炎症因子的蛋白表达均显著升高(P0.05,P0.05和P0.01),证实Npc1~(-/-)小鼠肝脏晚期发生炎症反应;Masson染色未发现Npc1~(-/-)小鼠肝脏纤维化的发生;TUNEL染色显示,Npc1~(-/-)小鼠肝脏组织凋亡细胞数量增加。5.细胞免疫荧光染色结果显示:Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)组的TCs细胞表面标记物VimentinCD34、VimentinPDGF-a、Vimentinc-Kit均出现共表达。6.TEM扫描结果显示Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)组TCs的细胞核/细胞质的比例比其他类型的细胞相对较大,胞体直径约8-16um。Npc1~(+/+)组TCs细胞质中细胞器十分丰富,如微丝、高尔基体、线粒体、微管、中间丝等结构,而Npc1~(-/-)组TCs细胞质中的细胞器比例低于Npc1~(+/+)组。7.普通显微镜下和SEM扫描结果显示Npc1~(+/+)和Npc1~(-/-)组TCs的细胞结构主要由胞体和突起(Telopodes,Tps)构成。细胞的胞体较小,细胞核根据Tps的数量呈梭形、星形或纺锤形。TCs细胞膜表面凹凸不平,两组之间的形态学无差异。8.油红O染色、茜素红染色和细胞免疫荧光对诱导后的肝脏TCs进行鉴定结果显示:Npc1~(-/-)组TCs诱导后的阳性率均显著低于Npc1~(+/+)组。结论Npc1基因突变导致肝脏组织形态发生改变,大量巨噬细胞聚集引发炎症反应,而炎症反应的发生可能是引起肝脏细胞凋亡和肝功能受损的重要原因之一;随后研究发现肝脏TCs在诱导条件下可向成脂、成骨、成心肌样细胞分化;而Npc1基因突变对肝脏中TCs的多向分化潜能具有抑制作用。
【图文】：

图1 NPC1小鼠基因型鉴定结果杂合型：Npc1+/-；突变型：Npc1-/-。W：野生型引物；M：突变型引物 results of NPC1 mice+; Heterozygote: Npc1+/-; Mutant: Npc1-/-; W: Wild type primers; M: Muta图2. P60 Npc1+/+和 Npc1-/-小鼠体重、肝脏重量及肝功能的比较分析

附图图1 NPC1小鼠基因型鉴定结果野生型：Npc1+/+；杂合型：Npc1+/-；突变型：Npc1-/-。W：野生型引物；M：突变型引物；Marker：分子量标准Fig.1 Genotyping results of NPC1 miceWild type: Npc1+/+; Heterozygote: Npc1+/-; Mutant: Npc1-/-; W: Wild type primers; M: Mutant primers.
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.8

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7 周，

本文编号：2594008