西安地区肠道病毒71型的分离鉴定及单克隆抗体的制备

发布时间：2020-03-23 22:36

【摘要】： 肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属的成员,最初由Schmidt等从脑脊液中分离出来,世界上许多国家相继报道了EV71病毒在不同地区流行情况,近来在我国也呈逐年上升趋势,感染EV71后,除了可以引起手足口病、疱疹性咽峡炎以外,还可以导致无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、神经性肺水肿、心肌炎等疾病,严重威胁着儿童的生命健康。 EV71病毒由60个相同的亚单位构成,每个亚单位均包含VP1～VP4四种结构蛋白,据病毒衣壳蛋白VP1序列(891bp)的变异情况,将其分为A、B和C三个基因型,近年的研究表明[ 1 ],基因型B和C又可进一步分为不同亚型(B1～B5和C1～C4)。目前对EV71的分子流行病学研究主要是VP1、VP4基因及5’-UTR区的变异,而VP1最具有研究价值,因为它直接决定病毒的抗原性,是病毒主要的中和决定因子,有遗传变异多样性的特点,5’-UTR结构涉及病毒的宿主范围和病毒的毒力等多个方面的功能。肠道病毒71型遗传学上具有多变性,同一地区不同时间流行的EV71易发生基因型转换,导致临床症状在不同地区和不同时间均有差异。大多在一周内可恢复,但少数低龄患儿可能只表现出中枢神经系统感染症状,增加了早期诊断的难度,目前,对EV71致病的分子机制了解还很少,通过何种受体进入宿主细胞尚不明了,现在还没有研制出安全有效的特效药和疫苗,所以,对这种病原体及时快速的检测对于手足口病的诊治有着至关重要的作用。目的对西安地区肠道病毒71型流行株进行分离鉴定,经初步提纯,建立一种新的快速EV71抗体ELISA检测方法,以提纯获得的EV71病毒作为抗原免疫小鼠,制备肠道病毒71型西安株单克隆抗体,构建出稳定分泌表达的杂交瘤细胞株,测定腹水效价,为以后研究EV71病毒的生物学功能及其早期诊治防治奠定基础。方法 1.采集手足口病患儿咽部分泌物标本进行病毒分离和RT-PCR检测,利用免疫荧光技术进行鉴定,并将提取的病毒RNA进行核苷酸序列测定; 2.用聚乙二醇(PEG)沉淀法将分离的EV71病毒进行初步浓缩、提纯,获得大量高浓度的EV71抗原,然后直接应用抗原包被酶标板,用已知EV17抗体阳性血清鉴定所提纯抗原的免疫活性; 3.用浓缩提纯的EV71病毒作为免疫原免疫Balb/c小鼠,末次加强免疫后3天取脾细胞与骨髓瘤SP2/0进行细胞融合,用HAT选择培养基进行筛选,经过3次有限稀释克隆化,ELISA反复筛选,获得稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,接种于小鼠体内制备含有单克隆抗体的腹水,并检测腹水效价。结果 1.原始标本直接用RT - PCR法扩增,阳性7份,阳性率31.8% (7/22) ;接种于RD细胞后成功分离10份阳性标本,阳性率为45.4% (10/22);然后运用RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)从病毒培养上清中提取病毒RNA,发现病毒分离后再经RT - PCR检测的阳性率为68.1% , 2.病毒分离后经RT-PCR检测阳性条带切下测序,所得基因序列同GENEBAND报道的西安地区EV71流行株序列号(EU812461)完全一致,免疫荧光鉴定结果阳性; 3.分离提纯的EV71病毒作为抗原直接包被酶标板,检测经临床鉴定的EV71感染患儿阳性血清20份,阳性率85%,检测柯萨奇病毒抗体阳性血清均为阴性; 4.反复筛选获得2株稳定分泌抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞株:EM1、EM2,经过检测腹水中抗体效价为10~(-4)。结论 1. EV71病毒在RD细胞中能很好的增殖,通过病毒培养能提高标本中EV71的核酸检出率,标本在病毒分离前后的RT-PCR结果差异有统计学意义(χ~2 =4.9,P0.05),成功分离到西安地区肠道病毒71型流行株; 2.建立了一种新的间接ELISA检测方法,这种方法检测血清中EV71抗体是特异的,提示纯化抗原的免疫性好,为后面的实验结果提供可靠性; 3.获得2株稳定分泌抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备大量含特异性单克隆抗体的腹水,为进一步研究EV71病毒结构功能及早期诊治奠定了基础。
【图文】：

病毒颗粒

图 1 EV71 病毒颗粒结构EV71 病毒基因组为含有大约 7411 个核苷酸的单链 RNA，腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富，在 3’末端有多聚腺苷酸（polyA）尾，而其 5’末端共价结合有一个小分子量的蛋白（VPg），从基因组的 5’末端至 3’末端依次排列着 746 个核苷酸的 5’-非编码区（untranslation region，UTR）、编码区1A（多肽 VP4）、1B（多肽 VP2）、1C（多肽 VP3）、1D（多肽 VP1）、2A（特异性蛋白酶）、2B、2C、3A、VPg（5’-末端结合蛋白）、3C（特异性蛋白酶）、3D（RNA 多聚酶组分）、3’末端非编码区（83 个核苷酸）以及多聚核苷酸尾，在病毒 RNA 正链和负链 5’-末端和 3’-末端非编码区中分别含有多肽翻译的起始信号以及 RNA 合成起始信号，通过其酪氨酸残基的羟基基团，VPg 蛋白与 RNA5’-末端的 pUpU 形成磷酸二酯键，再进一步与基因组RNA 结合[3]。5’-UTR 结构还涉及病毒的宿主范围和病毒的毒力等多个方面的功能，，但 3’-UTR 区和多聚腺苷酸尾的功能目前还不清楚，病毒的单链

电泳图,电泳图,产物,标本

图1-2 RT-PCR产物电泳图为DNA Marker；1.咽试子标本；2、3病毒培养上清；性对照；5.阳性对照标本在病毒分离前与分离后RT-PCR结果比较T-PCR分离后RT-PCR阳性阴性总 6 1 9 6 15 7 测定结果因序列同GENEBAND 报道的西安地区EV71流行M 1 2 3 4 5
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R725.1

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