实时PCR技术用于重症联合免疫缺陷病和先天性肾上腺皮质增生症的新生儿筛查研究

发布时间：2020-03-28 06:50

【摘要】：新生儿筛查(Newbornscreening,NBS)是预防医学的一项重要措施,可以在患儿尚未出现临床症状前通过体内代谢变化进行及时筛查,及早预防与治疗,有效规避患儿重要脏器发生损害,保障儿童正常的体格与智能发育。本研究针对美国医学遗传学会中公布的两项核心疾病重症联合免疫缺陷病(Severe combined immunodeficiency,SCID)和先天性肾上腺皮质增生症(Congenital adrenal hyperplasia,CAH)进行了基因检测方法的探究,同时发展了一种血斑DNA的快速提取方法,开展了实时PCR快速检测方法的研究。第一章绪论部分,依次介绍了新生儿筛查的目的、意义、流程、国内外发展现状、优势及实时荧光PCR方法的简介和原理。最后对本文的研究内容进行了介绍,重点阐述了如何将实时PCR技术应用于新生儿疾病的筛查中。第二章探究与优化血斑DNA提取的方法,通过对四种不同提取方法的比对与优化,最后确定利用chelex100的方法提取血斑标本。该方法具有简单、高效、成本低等优点,适合于快速提取血斑。第三章描述了单管多重实时荧光定量PCR体系,用于定量血斑标本中的TRECs,以实现筛查新生儿中SCID检测。体系包含一个参照基因RPP30与一个检测对象TREC,利用RPP30对TRECs进行相对定量,计算新生儿在1000,000个外周血单核细胞中TRECs的含量,从而确定正常新生儿中TRECs的cut-off值,若标本检测结果中TRECs的含量低于cut-off值则判定为阳性标本。第四章描述了两轮PCR扩增体系,检测CYP21A2基因常见的突变,CYP21A2突变是引起CAH主要原因。由于CYP21A2基因与CYP21A1P基因高度同源,所以需要通过预扩增体系实现CYP21A2基因的特异扩增。预扩增体系的建立实现了对低质量、低浓度的血斑标本进行长片段扩增,扩增子约3.5kb。第二轮体系利用多色探针熔解曲线分析技术同时对中国人群中13个常见的突变进行检测。通过检测524份随机的血斑标本,基因分型结果与金标准Sanger测序结果一致为100%。检测16份临床标本,体系检测出的点突变基因分型与临床信息一致,其中3份标本携带大片段缺失,超出了体系检测范围。该体系简便快捷、易于使用且基因分型结果准确,适合新生儿CYP21A2基因突变检测。
【图文】：

扩增兄ＰＰ３０基因对不同提取方法的性能进行考察和比较。逡逑每种提取方法均对６片直径为３ｍｍ的干血斑进行提取，每份标本使用实时逡逑荧光定量ＰＣＲ的方法做两个平行孔。图２－１则是以四种提取方法为横坐标，以逡逑干血斑标本ＤＮＡ的Ｃｑ值为纵坐标，比较四种方法的稳定性和提取浓度，由ＢＯＸ逡逑图和散点图可以看出，Ｃｈｅｌｅｘ邋１００的提取方法最稳定，Ｃｑ值最小，浓度最高。逡逑３２，逦邋３２，逦逡逑３１－逦．逦３１－逦．逡逑３０＇逦３０－逦？逡逑｜邋２９邋－逦Ｔ逦２９－逦？逡逑｜邋２８－ｆ＝＾逦２８－．．：：逦逡逑ｏ邋２７－邋。逦｜，－＾￣邋２７－逦？邋？？？邋？逦：邋：邋ｉ逡逑？邋２６N．Ｔ邋．邋ｔ＝＝ｄ邋２６－邋：．逦．逦：邋ｉ邋：逡逑°逦２５逦｛逦２５逦？？？？？？？？逦．逡逑２４邋－逦２４－逦＊逡逑２３逦１逦１逦１逦１逦邋２３逦１逦＞逦＇逦逦逦逡逑仪器自动提取热喊法（＾６以１００碱性？￡０邋２００仪器自动提取热y法（＾６＾１００喊性？日０邋２００逡逑图２－１：干血斑不同提取方法比较逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１：邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｍｅｔｈｏｄｓ邋ｆｏｒ邋ｄｒｉｅｄ邋ｂｌｏｏｄ邋ｓｐｏｔｓ逡逑这四种提取方法中提取时间最短的方法为碱性ＰＥＧ邋２００方法，但该方法与逡逑Ｃｈｅｌｅｘ邋１００方法比对提取效率较低，综合各项因素，Ｃｈｅｌｅｘ邋１００方法提取血斑标逡逑本为最优方法

每位志愿者的提取两份直径为３ｍｍ的干血斑，共提取６片直径为３＿逡逑的干血斑。将提取出的标本使用实时荧光定量ＰＣＲ的方法考察浓度，每份标本逡逑做两个平行管。最终结果如图２－２所示，，标本浓度集中在ｌＯＯｃｏｐｉｅｓ／＾Ｌ－ｌＯＯＯ逡逑ｃｏｐｉｅｓ／ｐＬ邋之间。逡逑４Ｆ逦邋３５，逦逡逑ｆ“、逦Ｙ＝－３．５３０Ｘ邋Ｌｏｇ（ｘ）＋３３．８３６逡逑３０邋？邋＼邋＝逡逑０逦１０逦２０逦３０逦４０逦５０逦１0、逡逑Ｃｙｃｌｅ邋Ｎｕｍｂｅｒ逦Ｃｏｎｃ（ｃｏｐｉｅｓ／ｐＬ）逡逑图２－２：血斑标本浓度考察逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２：邋Ｓｔｕｄｙ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂｌｏｏｄ邋ｓｐｏｔ邋ｓａｍｐｌｅｓ逡逑２２逡逑
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R722.1

【参考文献】

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本文编号：2604092