荧光定量PCR对小儿肺炎支原体感染早期诊断价值和临床意义的研究

发布时间：2020-04-02 05:57

【摘要】： 目的肺炎支原体是下呼吸道感染及社区获得性肺炎的常见原因,在儿童引起了大约6-20%的后天免疫性肺炎及下呼吸道感染。根据种群及已知的诊断实验研究在后天免疫性肺炎及下呼吸道感染中肺炎支原体的发病率占1-30%,支原体培养非常困难,因此,传统上临床诊断主要依靠血清学方法,在急性期血清学方法敏感性欠佳,有恢复期的标本常使诊断更精确但需要起病后很多天,根据以往的血清学方法及已实验的人群其敏感性和特异性在55-100%,最近,分子技术发展起来了,它对于肺炎支原体的病原诊断非常重要,因为在临床上肺炎支原体同其他的细菌感染无明显差别,对β内酰胺类抗生素无效,在下呼吸道感染中常经验性治疗,为了及时有效的治疗需要一个快速的诊断方法。同其他的方法相比,PCR法提供潜在的增高的敏感性和快速性,因此,对于肺炎支原体的诊断,很多实验室开展了核苷酸序列的扩增技术。 FQ-PCR技术是近些年发展起来的新的核酸检测技术,该技术把PCR的高灵敏性、DNA杂交探针的高特异性和光谱技术的高精确定量融为一体。它出结果快,一般在2个小时内,可以及时地提供给临床,可以对病原定量,并且没有普通PCR的后续处理步骤,与传统PCR相比,明显地降低了污染的发生,本研究旨在探讨荧光定量PCR对小儿肺炎支原体感染的早期诊断价值和临床意义,尤其是对于婴幼儿及免疫能力差产生抗体不足者。对象与方法一、研究对象的选取 (一)实验组 2006年10月～2007年3月我院儿科呼吸门诊122例下呼吸系统感染者,其中男64例,女58例;年龄2个月～14岁。≤3岁:53例,3岁-6岁:41例,≥6岁:28例。性别比例无显著性差异。均以发热咳嗽为主要症状,其中肺炎57例,支气管炎65例。所有检测对象检测前3天均未用红霉素等大环内酯类生素。 (二)对照组 20例,同期于我院门诊取无呼吸道感染的正常儿童咽拭子。年龄2个月-14岁,≤3岁8例,3-6岁7例,≥6岁5例,男11例,女9例。与实验组无性别及年龄差异二、方法 (一)主要仪器及试剂 SLAN荧光定量分析仪,超净工作台,离心机,振荡器,肺炎支原体荧光定量PCR试剂盒,计算机,零下20度冰箱。 (二)标本采集用无菌生理盐水浸过的棉拭子直接擦拭咽后壁,然后浸于1毫升无菌生理盐水中震荡,密封冰盒运送,零下20度保存,用以PCR检测;就诊当天或第2天及相隔一周到两周后采集静脉血,用以明胶微量颗粒凝集法抗体测定。 (三)MP感染诊断标准双份血清抗体有4倍以上升高或单次血清抗体滴度≥1:160作为肺炎支原体感染诊断标准。 (四)检测 1、从冰箱中取出标本,解冻后提取DNA。 2、从冷藏室取出试剂盒,复温至室温。 3、启动SLAN荧光定量PCR分析仪,将样品及阳性质控品阴性对照分别放入,分析软件自动得出实时扩增曲线及计算结果。 (五)统计学分析组间阳性率比较用X~2检验,使用SPSS10.0软件,P＜0.05表示有显著性差异。实验结果一、咽拭子FQ-PCR与颗粒凝集法检出率比较在122例患儿中FQ-PCR共检出34例,颗粒凝集法共检出30例,FQ-PCR的敏感性是86.67%,特异性是91.30%,阳性预测值是76.47%,阴性预测值是97.67%,两者符合率是90.16%,经统计学处理,X~2检验,两种方法无显著性差异。(P＞0.05) 二、咽拭子FQ-PCR与首次滴度＜1:160的阳性率比较在110例中首次滴度＜1:160者中,双份血清有4倍增高者有18例,其中FQ-PCR检出16例,FQ-PCR与二次血清抗体滴度升高的符合率为90.90%,因此,FQ-PCR可作为肺炎支原体感染的早期诊断手段,尤其是在疾病初期。三、各年龄组检出情况比较两种方法均在6岁以上学龄儿童组检出率最高,但FQ-PCR在婴幼儿组亦有较高的检出率。四、对照组检出情况在20例正常对照组中有1例FQ-PCR阳性。结论 1、FQ-PCR与颗粒凝集法对于检测小儿肺炎支原体感染有较好的符合率,具有较高的敏感性和特异性。 2、FQ-PCR与双份血清抗体检查有较高的符合率,因此具有早期诊断价值。 3、FQ-PCR对于婴幼儿比颗粒凝集法有更高的诊断价值,并且操作简单,便于临床推广普及。
【图文】：

扩增曲线,样品,检出,预测值

在闽值之上出现扩增曲线，Ct值<38，实验结果为阳性，由仪器自动算出DNA含量(基因拷贝数/ml)。Ct值)40，实验结果为阴性，38)Ct值毛40为灰区，建议复查。如图3示(3条阳性质控品和5条阳性样品的扩增曲线)图3，FQ一PCR阳性结果(3条阳性质控品和5条阳性样品的扩增曲线)三、咽拭子「O一pCR与颗粒凝集法阳性率比较在122例患儿中颗粒凝集法共检出30例，FQ一PCR共检出34例，FQ一PCR的敏感性是86.67%，特异性是 91.30%，阳性预测值是76.47%，，阴性预测值是97.67%，两者符合率是90.16%
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R725.6

【参考文献】