枫糖尿症患儿临床特征、基因突变分析及诱导型多能干细胞系的建立

发布时间：2020-04-02 06:55

【摘要】：研究背景枫糖尿症(maple syrup urine disease,MSUD)是一种罕见的常染色体隐性遗传病,死亡率和致残率高,临床危害性大。MSUD总体发病率为1:185000,我国关于枫糖尿症的研究甚少,缺乏大数据统计,发病率不明。MSUD是由于细胞线粒体基质内支链a酮酸脱氢酶多酶复合体(BCKDC)功能缺陷导致的支链氨基酸代谢病。BCKDC包括E1(分为E1a及E1β两个亚基)、E2、E3、BCKD激酶和BCKD磷酸酶,任何一个亚单位发生变化,均会影响其分解代谢的功能;而调控BCKDC复合体的酶功能异常如PPMIK(mitochondrial protein phosphatase线粒体蛋白磷酸酶)也会引MSUD。以上成分缺陷均可导致高浓度的支链氨基酸及其酮酸衍生物在机体血液、尿液、脑脊液中蓄积,阻碍脑组织的能量代谢,从而出现一系列神经系统症状。目前已明确的MSUD 致病基因有BCKDHB、DLD、DBT和PPMIK。MSUD根据其发病时间、病情进展速度及对维生素B1的反应性,可分为经典型、间歇型、中间型、维生素B1有效型和E3亚单位缺陷型。其中经典型是新生儿时期最常见的类型,病情严重,主要临床表现为反应差、频繁惊厥、低血糖等,常于数日内死亡。由于其临床表现缺乏特异性,易造成误诊而延迟治疗,导致该病死亡率居高不下或引起高致残率。故早诊断、早干预和早治疗,提高患儿的存活率,改善生存质量是目前临床迫切需要解决的课题。长期以来,MSUD基因功能与发病机制的研究受限于研究模型的建立,诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)是由体细胞经重编程而获得的具有胚胎干细胞特性和功能的多能干细胞,患儿来源的iPSC作为遗传性疾病的研究模型已经广泛应用于基础研究。因其无伦理问题,具有多项分化潜能,经诱导可分化为各种类型的体细胞,且携带疾病特异性的缺陷基因,为研究罕见遗传性疾病的发病机制提供了革命性的技术手段。本课题在前期遗传代谢病筛查工作基础上对7例高度疑诊MSUD的患儿进行了详细的临床表型、实验室检查以及遗传学分析,发现7例患儿中5例为BCKDHB基因突变,2例为BCKDHA基因突变,其中7个突变为未曾报道的新突变。为进一步明确新突变的致病性,我们采集了一例存活患儿的外周血诱导为iPSC细胞并进行了鉴定,又对基因突变位点和蛋白表达进行了检测验证,构建起MSUD患儿的iPSC细胞体外研究模型,为进一步深入研究MSUD的发病机制,探索基因功能,进行药物筛选和可能的基因治疗奠定了基础。第一部分枫糖尿症患儿临床特征、基因突变分析目的分析7例MSUD患儿的临床特征及其基因突变类型,总结其发病特点探索疾病表型与基因型的关系,以期早期诊断、早期干预和早期治疗,尽可能挽救患儿生命,提高新生儿的存活率,改善患儿生活质量。方法通过血液、尿液质谱筛查出7例高度疑似MSUD的患儿,进行临床表型分析、常规实验室检查及基因检测和生物信息学分析,具体方法如下:1.临床资料与检查:采集现病史、喂养史、个人史、家族史等资料,进行体格检查。2.实验室检查:血常规、生化检查、血气分析、脑脊液常规、血液氨基酸、尿液有机酸检查等。3.影像学检查:头颅核磁共振或超声检查。4.脑电图检查:振幅整合脑电图监测。5.分子遗传学检查5.1采用目标区域捕获结合新一代测序技术,对7例患儿进行高通量测序,重点分析与MSUD相关基因(BCKDHA,BCKDHB,DBT,DLD,PPMIK)的外显子与相邻的内含子区域(50bp)。5.2生物信息学分析:测序数据应用NextGene V2.3.4软件与UCSC hg19人类参考基因组序列进行比对,并对目标区域内的覆盖度和测序质量进行评估;依据严格的筛选标准对变异进行过滤,然后通过HGMD、ClinVar、OMIM数据库查找突变信息;UCSC、Ensembl数据库和Clustx进行蛋白质保守性预测;Mutation taster、PolyPhen2等生物信息学软件预测变异的致病性;Swiss-PDB Viewer软件进行蛋白质三级结构预测等;对检测到的潜在致病性变异进行患儿及其父母的验证:点突变和小的插入缺失突变采用Sanger测序验证,对于大片段缺失及重复突变采用实时定量PCR验证。6.患儿临床表型与基因型关系分析:根据7例患儿的临床表现及病情进展情况对枫糖尿症进行临床分型,并与其基因型进行比较和分析。结果1.临床检查:7例患儿中男5例,女2例,发病日龄均小于10天,主要临床表现为易激惹,反应差,喂养困难,肌张力异常,惊厥等。诊断的时间从4-5小时至生后22天不等,(其中第7例入院后4-5小时被高度疑诊为MSUD)。7例病人中,病例1和病例2表现为肌张力增高,余表现为肌张力降低;病例1,4,5,6,7出现惊厥;病例1,3,4伴有不同程度发热;病例3,4,5,7表现为酸碱失衡包括呼吸性酸中毒、呼吸性碱中毒和代谢性酸中毒;病例6需要机械通气,病情进展迅速;病例1,3,4,5,6患儿分别于生后17天,33天,10天,18天,22天死亡;病例2存活时间较长,但明显发育迟缓;病例7仍需临床观察。2.实验室检查:2.1血常规检查:病例2在40天日龄时发现合并严重贫血,经过枫糖尿症的综合治疗,血红蛋白在患儿3岁3个月时上升至正常水平120g/L;病例5存在轻度贫血,其余患儿无贫血情况。2.2生化指标检测:血糖监测病例2偏低为2.8mmol/L;血氨检测病例2,3,4,5轻度升高,病例7进行性升高;血清谷氨酰胺转肽酶结果除病例3正常外,其余患儿均明显升高在95.14-178U/L;除病例3血清淀粉酶正常外,其余均降低;血清心肌酶检测显示血清乳酸脱氢酶和羟丁酸脱氢酶均存在不同程度升高,除病例1血清肌酸激酶正常,其余患儿均升高在224-330 U/L之间。2.3血气分析:病例3存在轻度呼吸性酸中毒,病例4存在轻度呼吸性碱中毒,病例5和7为代谢性酸中毒并呼吸性碱中毒,病例1和6的血气分析结果均在正常范围,病例2未做血气分析检查。2.4脑脊液检查:出现惊厥的患儿1,4,5,6,7脑脊液氯化物、糖在正常范围,脑脊液蛋白均高于正常,但细胞数均低于10×106/L,细菌检测阴性。2.5血液氨基酸检测:除病例2的缬氨酸水平在正常范围外,其余患儿缬氨酸水平在300.01-744.48umol/L之间;亮氨酸加异亮氨酸在605.91-3249.18umol/L;亮氨酸加异亮氨酸/苯丙氨酸在16.91-100.19umol/L。2.6尿液有机酸检测:大多患儿显示支链α酮酸明显升高,如2-羟-异戊酸水平在181.2-446.76之间;2-酮-异戊酸水平在101.92-207.97之间;2-酮-3-甲基戊酸水平在58.1-442.98之间;2-酮-异已酸水平138.2-679.11之间。3.影像学检查结果:头颅磁共振显示:符合代谢性脑病的影像表现,两侧脑桥、中脑、延髓、小脑蚓部、丘脑、放射冠、半卵圆中心、双侧苍白球、内囊等部位均呈现广泛异常高信号;病例6,7的头颅MRI结果显示双侧基底节区、脑干、小脑内可见对称性异常信号影,证实为代谢性脑病的影像学改变;病例1床边头颅彩超显示:双侧室管膜下均探及囊状液性暗区,双侧脑实质回声略增强。4.脑电图及其他检查结果:病例6显示:异常振幅整合脑电图,波形连续,电压波幅在正常范围,睡眠周期欠佳,可见散在尖波、棘波、快波、监测过程中可见一次痫性放电。5.分子遗传学检查结果:7例患儿中1,2,3,4,6例具有BCKDHB基因突变,包括4例复合杂合突变,1例纯合突变;2例(病例5和7)为BCKDHA基因复合杂合突变。其中7个为未曾报道的新突变,包括c.863GA及外显子5-9大片段缺失属于基因突变,c.523TC、c.659delA、c.550delT、c.665AC及外显子1-7大片段缺失属于BCKDHB基因突变。6.临床表型与基因型关系分析:患儿均为BCKDHB和BCKDHA基因突变导致,但其临床表型与基因型无对应关系,其中病例1,3,4,5,6为经典型MSUD,预后差,死于出生后17天-33天;病例2属于中间型;病例7的起病特点与经典型一致,但是临床进展过程类似维生素B1有效型,仍需临床观察。结论BCKDHB与BCKDHA基因可能是本地MSUD的主要致病基因;BCKDHB基因的一个新突变c.659delA可能是本地MSUD患儿的突变热点;血液氨基酸与尿液有机酸筛查有助于快速筛查MSUD,便于临床及时采取治疗措施;新一代测序技术可以精准诊断MSUD并且发现新的突变基因。第二部分MSUD患儿来源iPSC细胞系的建立目的建立MSUD患儿来源的iPSC细胞系,为进一步深入研究MSUD的发病机制,探索基因功能以及药物筛选和基因治疗奠定基础。方法1.iPSC细胞的诱导:以第7例MSUD患儿为例,采集MSUD患儿外周血分离有核细胞,采用非整合重编程技术应用电转仪对细胞进行核转染,直至出现明显的干细胞形态,挑取克隆继续培养。2.iPSC细胞系的鉴定:培养至第十代时,采用细胞免疫荧光技术对iPSC细胞进行多能性分子标记物鉴定;利用qRT-PCR检测内源性多能基因OCT4、SOX2、NANOG的表达;采用拟胚体自分化验证iPSC细胞多向分化潜能,qRT-PCR来分别检测三个胚层的分子标记物表达情况;对多能干细胞进行PCR验证外源基因表达;对iPSC进行染色体核型分析,鉴定核型是否正常。3.基因突变的验证:采用Sanger测序技术,在3130XL DNAAnalyzer分析仪上测序验证基因的突变位点;应用Western blot蛋白印迹对缺陷蛋白质的表达进行分析,并与正常对照相比,最后进行统计分析。结果1.iPSC细胞的诱导:采用非整合重编程技术诱导的患儿来源的外周血细胞呈现显著的胚胎干细胞形态。2.iPSC细胞系鉴定:免疫荧光结果显示iPSC可以检测到多种多能性标志物的表达,如 TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA4 以及 OCT3/4 和 NANOG;qRT-PCR 检测显示三种内源性多能基因OCT4、SOX2、NANOG都有表达;iPSC分化形成典型的胚状体结构,并可以检测到内、中、外胚层的特异性标志物SOX17、GATA4、RUNX1、HAND1、PAX6以及NR2F2的表达,表明患儿来源的iPSC具有分化成三个胚层的潜能;对诱导产生的多能干细胞的染色体核型进行鉴定,显示为正常核型且无异常染色体发现;PCR结果显示iPSC无外源基因表达。3.基因突变验证:Sanger测序验证显示患儿来源的iPSC在BCKDHA基因上存在与患儿相同的c.632CT及c.1280-1282delTGG复合杂合突变。Western blot蛋白质表达分析结果显示,患儿来源的iPSC细胞中BCKDH-E1α表达量与对照组(日龄、性别相匹配的非遗传性疾病新生儿)相比明显降低(P0.01)。结论采用非整合重编程技术建立起MSUD患儿外周血来源的iPSC细胞系;该iPSC细胞系携带有与患儿相同的c.632CT及c.1280-1282delTGG复合杂合突变;该细胞系的建立为进一步研究MSUD的发病机制、基因功能及药物筛选奠定了基础。
【图文】：

患儿,验证结果,证据,杂合

生物信息分析软件Ｍｕｔａｔｉｏｎ＿Ｔａｓｔｅｒ预测有害（见图２．２），按照ＡＣＭＧ标逡逑准，ｃ．６５９ｄｅｌＡ邋突变定义为致病性突变（ＰＶＳｌ＋ＰＭ２＋ＰＰｌ＋ＰＰ３＋ＰＰ４）0ＰＶＳｌ：邋（ｖｅｒｙ逡逑ｓｔｒｏｎｇ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）极强的致病证据，又称为烈性突变，为功能缺失型突变，逡逑本患儿的框移突变属于此类范畴；ＰＭ２邋（ｍｏｄｅｒａｔｅ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）为较强的致病逡逑证据，在邋ＥＳＰ邋（Ｅｘｏｍｅ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋Ｐｒｏｊｅｃｔ），，１０００邋Ｇｅｎｏｍｅｓ邋Ｐｒｏｊｅｃｔ邋和邋ＥＡＣ邋（Ｅｘｏｍｅ逡逑Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ邋Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）中的等位基因频率是０，允许低频的隐性遗传突变频率。逡逑ＰＰ邋（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）为支持的致病证据。疾病／表型为ｌｂ型。逡逑Ａ逦□逦＇逦：逡逑ｘ＾ｕ逦１ＪＵ逡逑ＴＡＴＣ邋ＧＣＴＡＴｉＧＣＴＣＴＧＧＧ逡逑？邋Ｃ．５０８Ｃ＾Ｔ逡逑／ＷＶ＼ＡＡＡ／Ｖ＼ｉＡＡＡ邋八邋Ｍ邋八八逡逑６０逦７０逦８０逡逑■邋佭邋■■■■■■■逦ｗｍ逦ｈ逦■逡逑；Ｃ邋Ｃ邋Ｃ邋Ｔ邋Ｔ邋ＴＣＣｉ逦Ｇ邋Ｇ邋Ｃ邋Ｃ邋Ａ邋Ａ邋Ａ邋Ｇ邋Ａ邋Ａ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｃ邋Ｃ逡逑■邋ｃ．６５９ｄｅｌＡ逡逑图２．丨．Ｓａｎｇｅｒ测序验证结果显示，患儿尺Ｄ／／５基因第五和第六外显于分别具有两个逡逑突变：ｃ．５０８Ｃ＞Ｔ邋（ｐ．Ｒ１７０Ｃ）和ｃ．６５９ｄｅｌＡ邋（Ｑ２２０Ｒｆｓ＊１０）

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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.8

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