GeXP系统在氨基糖苷类抗生素多重耐药基因检测及手足口病病原谱分型中的应用

发布时间：2020-04-03 19:48

【摘要】：目的: 1、建立一种多重PCR体系,同时检测细菌氨基糖苷类抗生素7种耐药基因aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ、ant(30)-Ⅰ、aph(3')-Ⅳ、armA和rmtB,通过对56份临床分离的肺炎克雷伯杆菌株的耐药基因检测,评价该多重PCR体系的临床应用。 2、建立一种多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,分型检测引起人手足口病的9种常见的人肠道病毒——人肠道病毒71型(HEV71)、柯萨奇病毒A组(CVA)16、4、5、9、10型和柯萨奇病毒B组(CVB)1、3、5型,通过对180份临床粪便标本手足口病原的检测,评价该多重RT-PCR体系的临床应用。 方法: 1、多重耐药基因检测体系的建立及临床应用评价 (1)查询各靶基因序列,经ClustalX比对,选择保守区设计多重引物; (2)收集氨基糖苷类抗生素耐药菌株,提取细菌基因组DNA;(3)单重PCR验证各对引物特异性,建立GeXP多重检测体系,以已知阳性混合模板验证多重检测体系的特异性;(4)优化反应体系,以各阳性基因的克隆质粒对该检测体系灵敏度进行分析;(5)用此检测体系对临床上分离的56株氨基糖苷类抗生素耐药的肺炎克雷伯杆菌进行筛查,观察各种基因的分布情况,并与传统单重PCR和琼脂糖凝胶电泳分析结果比较,观察两种方法的一致性,对该多重体系的临床应用进行评价。 2、手足口病病原谱分型检测体系的建立及临床应用评价 (1)选取1对针对肠道病毒5’UTR区设计的通用引物PE,和10对针对于9个血清型肠道病毒VP1区设计的特异性引物,建立GeXP多重RT-PCR检测体系;(2)使用已知血清型的肠道病毒细胞培养物分析GeXP多重RT-PCR检测体系的特异性;(3)以TCID50定量的细胞培养物和克隆质粒体外转录的RNA梯度稀释液分析多重检测体系的灵敏度;(4)对180份临床粪便标本进行盲筛,并与毒株分离法、血清抗体中和试验和单重RT-PCR测序分析法汇总结果对照,评价GeXP多重RT-PCR肠道病毒分型检测体系的临床应用。 结果: 1、成功建立一种基于GeXP系统的多重PCR检测体系,同时检测7种氨基糖苷类抗生素耐药基因,检测灵敏度达10拷贝。GeXP多重PCR筛查56株肺炎克雷伯杆菌临床分离株,aac(3)-Ⅱ, aac(6')-Ⅰb, ac(6')-Ⅱ, ant(30)-Ⅰ, aph(3')-Ⅳ, armA和rmtB阳性率分别为71.43%,25.00%,14.29%,75.00%,17.86%,71.43%和30.36%。以传统单重PCR同时检测56株肺炎克雷伯杆菌临床标本,GeXP多重PCR检测方法检测灵敏度为83.33%～100%,特异性为85.71%～100%,与传统检测方法有较高一致率。 2、成功建立一种基于GeXP系统的多重RT-PCR检测体系,可同时扩增出人肠道病毒共有的保守片段的和型特异性片段。优化后的多重检测体系检测HEV71和CVA16细胞培养物的灵敏度达到100.05 TCID50,并可同时检测出其它7种肠道病毒RNA,其灵敏度为100拷贝。检测分析180份临床标本,结果发现GeXP多重RT-PCR体系在检测PE、HEV71和CVA16的灵敏度分别为98.79%、91.67%和91.67%,特异性分别为80.00%、98.48%和100%,其他7个血清型检测结果与传统分型方法汇总检测结果一致率为92.59%(25/ 27)。 结论: 1、成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,快速、灵敏地筛查氨基糖苷类抗生素7种耐药基因,该多重PCR检测体系与传统单重PCR具有较高一致性,可用于氨基糖苷类抗生素耐药基因的快速筛查。 2、成功建立了基于GeXP系统的多重RT-PCR体系,快速、灵敏、特异地检测引起手足口病的9种常见肠道病毒,该方法与传统病毒分型方法有较高一致性,可用于手足口病病原谱的分子流行病学调查。
【图文】：

同时采用毛细管电泳读取技术，因进行有效分析。第四，高灵敏度。Gen因特异性引物和通用引物，将多重 PCR基因的比例得以维持。这一策略克服了解决了多重偏爱扩增的问题，大大提高快速自动设计。引物及扩增片段经 Blast备选引物，并重新对引物进行设计或做。而且，该设计模块在 Primer3 基础上增论上不会产生引物二聚体等问题。010000200003000040000500006000070000150 175 200 225 250 275 300 325RoRef ARR.D03_050919087NSize (nt)152.43157.71162.61168.01173.72178.09184.11188.84197.58203.36206.55214.20219.00224.24227.77233.32238.36247.22255.27258.85264.28268.74275.21295.46325.295’3’3’特异性嵌合引物

结 果立多重耐药基因检测体系物验证试验结果株已知阳性基因的肺炎克雷伯杆菌基因组 DNA 单重引物电泳，结果显示 7 对引物均可分别扩增出特异性目的条带图 1 所示。PCR 产物双向测序结果拼接后输入 NCBI BL结果与 GENBANK 公布序列吻合，说明各对引物特异性好
【学位授予单位】：广州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R725.1

【引证文献】

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1 卢昌;吴国华;颜新敏;赵志荀;李应国;聂福平;张强;;GeXP多重基因表达分析系统及其应用[J];中国兽医科学;2013年02期

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本文编号：2613627