我国婴儿利什曼原虫诱导中性粒细胞形成NETs的作用及其机制研究

发布时间：2020-04-08 06:19

【摘要】：目的:中性粒细胞可通过形成中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps,NETs)发挥重要的免疫调控作用。机体NETs的免疫反应和表达量与疾病病症存在一定的相关性。流行于荒漠地带婴儿利什曼感染诱发的内脏利什曼病(亦称黑热病)在我国流行区最广,危害最严重,尚无有效防制措施。研究我国婴儿利什曼原虫感染在中性粒细胞形成NETs方面的作用及其机制,对了解该原虫感染免疫调控机制和探索潜在治疗靶标提供重要的理论依据和分子基础。本研究采用致荒漠型黑热病的婴儿利什曼原虫新疆伽师株(MHOM/CN/2008/JIASHI-5),以下简称婴儿利什曼原虫,建立婴儿利什曼原虫感染小鼠模型,分析婴儿利什曼原虫感染对宿主小鼠外周血中性粒细胞产生NETs能力的影响,并进一步探索婴儿利什曼原虫诱导NETs形成的机制。方法:以腹腔接种的方式,建立婴儿利什曼原虫感染BALB/c小鼠模型。分别采集感染12周小鼠和正常小鼠外周血,分离纯化中性粒细胞。体外佛波酯(PMA)诱导中性粒细胞形成NETs。通过激光共聚焦扫描显微成像技术和流式细胞分析术,定性和定量比较婴儿利什曼原虫感染小鼠与未感染小鼠中性粒细胞形成NETs的差异,分析婴儿利什曼原虫感染对宿主中性粒细胞形成NETs能力的影响。采集正常小鼠外周血,分离纯化中性粒细胞。分别采用封闭酯氧素A4受体的拮抗剂(Boc)或刺激剂酯氧素A4(LXA4)预处理中性粒细胞以封闭或激活酯氧素A4受体。通过激光共聚焦扫描显微成像技术、游离dsDNA浓度测定和流式细胞分析术,比较不同实验处理组中性粒细胞在婴儿利什曼原虫前鞭毛体诱导下形成NETS的差异,分析酯氧素A4受体在婴儿利什曼原虫前鞭毛体诱导中性粒细胞形成NETs中的作用。利用1.25%二甲基亚砜(DMSO)诱导HL-60细胞分化为类中性粒细胞,基于RNA干扰(RNAi)技术构建酯氧素A4受体基因表达下调的类中性粒细胞模型。流式细胞分析术比较分析酯氧素A4受体基因表达下调的细胞在婴儿利什曼原虫前鞭毛体刺激下H3Cit(NETs标志物)表达的变化,进一步论证酯氧素A4受体在婴儿利什曼原虫前鞭毛体诱导中性粒细胞释放NETs中的作用。结果:1.激光共聚焦扫描显微镜成像发现,PMA体外刺激下,来源于婴儿利什曼原虫前鞭毛体感染小鼠的中性粒细胞形成NETs的比例增多,丝状或网状结构明显,附着在DNA骨架上的瓜氨酸化组蛋白H3(H3Cit)和髓过氧化物聚合酶(MPO)颗粒物的荧光数量增多。流式分析发现,H3Cit+MPO+中性粒细胞占总中性粒细胞的比例为(1.880±0.251)%,未感染小鼠的中性粒细胞的H3Cit+MPO+中性粒细胞占比为(0.623±0.087)%,感染小鼠的比例明显高于未感染小鼠(P=0.0014)。2.婴儿利什曼原虫前鞭毛体可有效诱导中性粒细胞形成NETs(P0.01);而拮抗剂Boc封闭酯氧素A4受体后的中性粒细胞,在婴儿利什曼原虫前鞭毛体诱导下NETs的释放量显著降低(0.01),但Boc无法完全抑制婴儿利什曼原虫前鞭毛体诱导NETs的形成;激活剂LXA4能一定程度诱导NETs的释放(P0.01);拮抗剂Boc可逆转LXA4的激活效应(P0.01)。3.HL-60细胞分化的类中性粒细胞,在婴儿利什曼原虫前鞭毛体诱导下H3Cit+类中性粒细胞的显著增高(P0.01)。酯氧素A4受体基因表达下调的类中性粒细胞相对未干扰的类中性粒细胞,在婴儿利什曼原虫前鞭毛体诱导下,H3Cit+类中性粒细胞比例显著降低(P0.01)。结论:1.我国婴儿利什曼原虫感染可改变宿主中性粒细胞免疫状态,显著增强中性粒细胞形成NETs的能力,并可能下调宿主免疫力。2.酯氧素A4受体是介导婴儿利什曼原虫前鞭毛体诱导中性粒细胞形成NETs的受体之一。3.中性粒细胞表面的酯氧素A4受体在利什曼原虫感染宿主细胞中发挥重要作用,酯氧素A4受体可作为控制黑热病的一个潜在靶点。
【图文】：

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本文编号：2619009