持续惊厥后新生神经细胞的增殖状况及脑源性神经营养因子对其电生理特征的影响

发布时间：2020-04-16 03:29

【摘要】： 第一部分持续惊厥后幼年鼠脑内神经发生的动态变化和迁移趋势 目的:探讨惊厥持续状态(status convulsion, SC)后未成熟大鼠脑内神经发生的动态变化。 方法:建立幼年Wistar鼠3h SC模型,在SC后0天至40天的7个时间点上处死动物,处死前1天腹腔注射5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo 2-deoxyuridine, BrdU);采用免疫组化方法动态检测海马、胼胝体下区(subcallosal zone, SCZ)和皮层在各时间点BrdU的表达,确定SC后各时间点上脑内不同区域神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的增殖水平和迁移趋势。 结果:⑴正常未成熟脑海马齿状回(dentate gyrus,DG)的颗粒细胞下层(subgranular zone,SGZ)和胼胝体下区(subcallosal zone,SCZ)以及皮层都存在少量BrdU阳性细胞;与对照组相比,SC后0天海马DG的SGZ,海马CA1、CA3区,SCZ以及皮层BrdU阳性细胞即开始显著升高,海马的SGZ、CA1、CA3以及皮层于SC后2天出现增殖高峰,SCZ于SC后7天出现增殖高峰。⑵SC后2天DG分子层出现BrdU阳性细胞,SC后7天DG门区出现BrdU阳性细胞。SGZ新生细胞有向DG分子层迁移趋势,SCZ细胞有向CA1、CA3和皮层迁移趋势。 结论:SC刺激未成熟脑内神经发生,部分新生细胞发生异位迁移,部分细胞可能向海马神经细胞损伤区迁移。 第二部分体外培养大鼠海马神经干细胞分化前与分化后电压门控钠、钾通道的表达 目的:观察体外分离培养大鼠海马神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化前后钠、钾离子通道的表达。 方法:无血清培养体外分离、纯化孕15-16天Wistar胎鼠的海马NSCs,nestin免疫荧光染色鉴定培养细胞是否为干细胞,无血清促分化培养基促分化,β-III-tubulin、GFAP荧光鉴定分化细胞类型。显微注射荧光黄标记记录细胞,采用β-III-tubulin免疫荧光染色检测所记录细胞是否具有神经元表型。膜片钳记录NSCs分化前和分化后具有神经元样细胞的电压门控钠、钾离子通道的表达, 结果:⑴体外培养的海马NSCs nestin免疫染色阳性,具有自我增殖能力能在体外诱导分化为神经元或胶质细胞;⑵膜片钳记录的细胞均具有神经元表型;⑶未分化NSCs无内向性钠电流,分化后1天即可检测到内向性钠电流;未分化和分化的NSCs均表达瞬时外向钾电流和外向延迟整流钾电流。 结论:⑴采用无血清培养方法,在体外成功分离海马NSCs;⑵神经发生过程中钠通道的功能性表达可能是NSCs退出细胞周期开始分化的标志。未分化和分化的NSCs表达两种类型的外向性钾离子电流。 第三部分脑源性神经营养因子对体外培养大鼠海马神经干细胞分化过程中被动膜特性和电压门控钠、钾通道电生理特征的影响 目的:探讨脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)对海马神经干细胞(neural stem cells, NSCs)被动膜特性和电压门控钠、钾通道电生理特征的影响 方法:采用无血清促分化培养基促NSCs体外分化,选择体外分化前期(1-4天)和体外分化后期(8-15天)具有神经元形态细胞进行膜片钳记录;记录细胞被动膜特性、钠电流,分析钠电流密度,拟合钠通道激活曲线,计算半数激活电压和斜率因子。记录总钾电流,分离瞬时外向钾电流和外向延迟整流钾电流;分析两种电流在分化前期和后期的表达情况;分析电流密度,拟合激活曲线,计算半数激活电压和斜率因子。 结果:⑴NSCs分化早期,BDNF促进静息电位左移,膜电容增加,输入阻抗降低,时间常数延长。⑵无BDNF干预,对照组钠电流密度随分化逐渐增加;BDNF干预后,分化前期,BDNF作用组钠电流密度明显高于对照组;而分化后期BDNF作用组钠电流密度明显低于对照组;BDNF长期作用使钠电流激活曲线右移。⑶所有记录的细胞都表达I_(K(DR)) ;无BDNF干预,对照组I_(K(A))的表达随着分化逐渐增加;BDNF干预后,I_(K(A))的表达随着分化逐渐降低;分化前期,BDNF作用组总钾电流密度较对照组明显增加;分化后期,两个实验组的总钾电流密度没有差异;无BDNF干预,随着分化对照组I_(K(A))和I_(K(DR))半数激活电压都发生左移;分化前期,与对照组相比I_(K(A))和I_(K(DR))半数激活电压也都发生左移,分化后期,BDNF作用组与对照组之间没有差异。 结论:⑴分化前期为细胞被动膜特性发育的关键时期,BDNF在NSCs细胞形态改变的同时促进NSCs来源的神经元样细胞被动膜特性发育,以促进NSCs被动膜特性趋向成熟化。⑵体外培养NSCs分化前期(1-4天)也是细胞钠、钾通道发育的关键时期;⑶BDNF促进分化早期钠通道的表达和/或开放,而长期作用则抑制钠通道的表达和/或开放;使钠通道激活曲线右移,具有抑制新生神经细胞兴奋性作用。⑷BDNF与I_(K(A))的表达密切相关,BDNF可能抑制I_(K(A))的表达,I_(K(A))在钾通道的发育过程中具有一定作用;BDNF促进分化早期钾通道激活曲线左移,钾电流密度增加,促进钾通道的表达和/或开放。⑸BDNF参与调节NSCs钠、钾离子通道发育关键时期,降低神经元样细胞兴奋性,对惊厥后的产生的神经细胞可能起保护作用。
【图文】：

图 2-1 钠电流、动作电位和钾电流刺激方案A: 内向钠电流刺激方案B: 动作电位刺激方案C: 外向钾电流刺激方案Fig.2-1 The protocol of eliciting inward sodium currents, action potential and oupotassium currentsA: The protocol of eliciting inward sodium currentsB: The protocol of eliciting action potentialC: The protocol of eliciting outward potassium currents⑷离子通道的 I-V 曲线制作：给予连续变化的步阶脉冲电压，测量出不同脉冲电压（Vm）下的全细胞峰值（Ip），，以 I 为 y 轴，Vm 为 x 轴，作出 I-V 曲线2 结果

断剂河豚毒素（tetrodotoxin,TTX,100nM）阻断，因此判断此电流为电压门子电流(INa)（图 2-5C）。采用电流钳，HP 设为-80mV,从 0mV 阶跃至+160m胞注入超过基强度的脉冲去激化电流，不能诱发动作电位产生（图 2-5D作用前后电流电压关系曲线（I-V 曲线）如图 2-5E 所示，TTX 可以明显抑性电流。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R720.597

【共引文献】

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本文编号：2629333