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克罗卡林在缺氧缺血性脑病新生鼠不同脑区的神经保护作用研究

发布时间:2020-04-16 07:13
【摘要】:背景与目的 新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)是由于围产期缺氧窒息致新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage,HIBD),临床上出现脑病表现,部分病例可留有不同程度神经系统后遗症,在围产期神经系统疾病中占重要地位,是引起儿童期脑瘫的主要原因。近年研究发现ATP敏感性钾离子通道(ATP-sensitive K~+ channels,K_(ATP)通道)开放对多种组织细胞缺氧缺血损伤有保护作用,该通道是电压非依赖性配体门控通道,在缺氧缺血等病理状态下被激活开放,使大量K~+外流,细胞膜超极化,从而使Na~+、Ca~(2+)内流减少,避免或减轻钙超载、减少能耗、减轻兴奋性氨基酸及氧自由基释放,保护细胞。克罗卡林是一种针对线粒体K_(ATP)通道特异性的钾通道开放剂(K_(ATP) channel opener, KCO),许多研究证实克罗卡林预处理能对抗缺氧缺血性脑损伤,具有神经保护作用,然而其具体保护机制尚不明确。本文以宫内窒息致HIBD新生大鼠为研究对象,观察不同脑区(皮质、海马、小脑、丘脑、脑干)K_(ATP)通道亚基蛋白(Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2B)基因表达情况,以及加用克罗卡林预处理后对不同脑区的保护作用不同,以期进一步阐明KCOs对脑保护作用的分子机制。该研究结果为深入认识K_(ATP)通道亚基蛋白在脑组织不同区域的表达情况提供依据,为开发特异性更高的K_(ATP)通道开放剂治疗新生儿HIE提供理论基础。 材料与方法 采用刚出生SD新生大鼠250只,分为五组,随机分为正常对照组(Control组)、缺氧缺血组(HI组)、克罗卡林组(Cro组)、溶剂对照组(NaOH组)及克罗卡林+格列苯脲(Cro+Gli)组,每组50只。HI组、Cro组、NaOH组及Cro+Gli组均制作成HIBD模型。分别在窒息后0h、12h、24h,共给药三次,克罗卡林每次按100ug/kg腹腔内注射,克罗卡林+格列苯脲组在上述相同时间点用克罗卡林后立即腹腔注射通道抑制剂格列本脲每次300ug / kg,抑制通道开放。NaOH组于同样时间点给予腹腔注射0.1M NaOH,体积同Cro组。 对各组动物进行神经行为学评分,采用HE染色观察病理改变和进行显微损伤评分,TTC染色测量脑梗死面积,RT-PCR方法检测K_(ATP)通道亚基蛋白(Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2B)基因表达情况。实验结果用EXCEL2003和SPSS13.0统计软件进行分析处理。结果以均数±标准差((x|-)±s)表示,采用重复测量分析(repeated measures)、方差分析(ANOVA)、LSD、SNK和Dunnett T3进行组间均数比较,P0.05为差异有显著性。 结果 1.神经行为观察及评分:正常对照组动物未见明显的神经功能缺失,窒息组(HI组)、溶剂对照组(NaOH组)缺血缺氧后症状较重,出现烦躁不安,惊跳,呼吸加深加快,随着缺氧时间延长,出现嗜睡,活动减少;重则抽搐、昏迷。克罗卡林组神经行为学评分较HI组及NaOH组低,克罗卡林+格列苯脲组神经行为学评分较克罗卡林组高(P0.05)。窒息组与溶剂组差异无统计学意义,P0.05,窒息组、溶剂对照组克罗卡林+格列苯脲组克罗卡林组正常对照组,P0.01,差异均有统计学意义。 2.HE染色病理变化和显微损伤评分:从常规HE染色的病理切片观察结果来看,正常对照组光镜下脑组织结构、层次清晰,细胞数目较多,排列规则,细胞轮廓及核仁清楚可见,细胞及间质无水肿;HI组及NaOH组可见大脑皮质神经元正常排列结构消失,间质水肿,神经细胞肿胀,核结构不清、固缩,继而变性、坏死,有空泡变,可见细胞凋亡,神经元数目明显减少;克罗卡林组脑组织细胞亦有不同程度的水肿、变性及坏死,神经元数目略微减少,多数细胞形态基本保持完整,细胞排列相对整齐,坏死程度较HI组及NaOH组减轻。克罗卡林+格列苯脲组脑组织形态特点较克罗卡林组重。HE显微损伤评分结果:每个脑区各组通过两两比较,窒息组、溶剂对照组差异无统计学意义,P0.05,窒息组、溶剂对照组克罗卡林+格列苯脲组克罗卡林组正常对照组,P0.05或者P0.01,差异均有统计学意义。每个脑区的窒息组进行对比,海马、皮质小脑、丘脑、脑干,差异有统计学意义(P0.01)。 3.通过TTC染色测量脑梗死面积提示:正常组整个脑组织呈红色,窒息组及溶剂组脑组织梗死区较大,克罗卡林组脑组织梗死区较小,克罗卡林+格列苯脲组脑组织梗死区较克罗卡林组大。通过两两比较,窒息组、溶剂对照组差异无统计学意义,P0.05,窒息组、溶剂对照组克罗卡林+格列苯脲组克罗卡林组正常对照组,P0.01,差异均有统计学意义。 4.RT-PCR方法检测K_(ATP)通道亚单位基因在不同脑区表达情况:不同脑区Kir6.1、Kir6.2各组进行比较,窒息组、溶剂对照组与克罗卡林+格列苯脲组、克罗卡林组、正常对照组对比,P0.01,差异均有统计学意义。窒息组与溶剂对照组对比,P0.05,差异无统计学意义。皮质区Kir6.2kir6.1,海马区Kir6.2kir6.1,P0.05,差异均有统计学意义。利用各脑区Kir6.2(克罗卡林组与对照组)比较,皮质区克罗卡林与对照组表达量相近,P=0.44,无统计学意义,而海马区P=0.29,也无统计学意义。小脑、丘脑、脑干P值均小于0.05,有统计学意义。不同脑区的SUR1、SUR2B各组进行比较,窒息组、溶剂对照组与克罗卡林+格列苯脲组、克罗卡林组、正常对照组对比, P0.01,差异均有统计学意义。窒息组与溶剂对照组对比,P0.05,差异无统计学意义。皮质区SUR2B SUR1,海马区SUR1 SUR2B,P0.05,差异均有统计学意义。 结论 1.本实验显示给予K_(ATP)通道开放剂克罗卡林能显著改善HIBD新生大鼠神经功能缺损程度,减少脑组织细胞的水肿、变性及坏死程度,减少脑缺血再灌注后梗死面积。提示K_(ATP)通道开放剂对脑缺血再灌注损伤具有重要的保护作用。 2.在新生鼠缺血缺氧性脑损伤后,通过脑损伤评分,海马及皮质评分最高,提示海马和皮质损伤程度最高。 3.同一脑组织不同部位K_(ATP)通道组成不同,而克罗卡林对损伤最严重的皮质区和海马区有较好的保护作用,格列本脲能抑制克罗卡林的脑保护作用。
【图文】:

神经细胞,新生鼠,海马,皮质


附图1:制作宫内窒息模型及正常新生鼠脑大体观附图2:显微神经细胞HE×400 倍:图2-1 正常组新生鼠皮质HE×400 图2-2 正常组新生鼠海马HE×400图2-3 窒息组新生鼠皮质HE×400 图2-4 窒息组新生鼠海马HE×400

新生鼠,皮质,海马,宫内窒息


附图1:制作宫内窒息模型及正常新生鼠脑大体观附图2:显微神经细胞HE×400 倍:图2-1 正常组新生鼠皮质HE×400 图2-2 正常组新生鼠海马HE×400图2-3 窒息组新生鼠皮质HE×400 图2-4 窒息组新生鼠海马HE×400
【学位授予单位】:汕头大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R722.1

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 黄广;林霓阳;肖育;;K_(ATP)开放剂克罗卡林对新生鼠缺氧缺血性脑损伤细胞凋亡的影响[J];中国妇幼保健;2006年07期

2 黄浩,李晓明,高天明;钾通道阻断剂TEA对大鼠全脑缺血后海马神经元损伤的保护作用[J];中国神经科学杂志;2001年02期



本文编号:2629529

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