流式细胞术检测儿童白血病细胞磷酸化信号蛋白的初步研究

发布时间：2020-04-19 07:22

【摘要】：研究背景急性白血病(Acute lekemia,AL)占小儿恶性肿瘤的首位,任何年龄均可发病,但以学龄前期儿童多见。我国0-10岁儿童白血病的发病率为3/10万-4/10万,严重威胁着儿童的健康。近20多年来,儿童急性白血病完全缓解(CR)率和5年无病生存率已经得到明显的提高。儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)通过化疗CR率已高达96-99%,5年无病生存率也达70%-80%,但是仍有约20%的患者治疗失败。尤其是急性髓性白血病(AML)的疗效远不如ALL,儿童AML的长期无病存活率不足60%。白血病细胞对化疗药物耐药是治疗失败的重要原因,然而,我们对白血病细胞内在的分子生物学特性还不是很清楚,白血病细胞增殖与耐药性是目前白血病治疗研究的热点之一。为了进一步认识白血病细胞的分子生物学特性和白血病细胞信号通路与白血病化疗敏感性的关系,我们研究与白血病细胞生存密切相关的信号通路,如PI3K/AKT、RAS/RAFMEK/ERK和JAK/STAT通路等,进行了初步的研究。现在已有研究证明这些通路与白血病发生、白血病细胞增殖、抑制细胞凋亡和引起细胞耐药相关。针对信号通路的分子靶向药物,部分已经进入临床实验阶段。近年来,流式细胞术应用于细胞信号通路的检测,发展出磷酸化流式细胞术(Phospho-specific flow cytometry, phospho-flow)。Phospho-flow能从单个细胞水平检测白血病细胞信号蛋白的激活,同时分析多个磷酸化信号蛋白之间的关系。Phospho-flow可应用于白血病以信号通路为基础的危险分型研究、新药开发的实验研究和分子靶向药物临床实验的药效监测,Phospho-flow具有潜在的临床应用价值。因此,我们建立Phospho- flow检测白血病患儿白血病细胞内磷酸化信号通路的实验方法,探讨Phospho- flow在白血病实验研究及临床应用。 P-AKT是PI3K/AKT通路中AKT的激活形式、P-ERK1/2是RAS/RAF/MEK/ERK通路的的激活形式、JAK/STAT通路的P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6,这3个通路的激活均与细胞的生存、凋亡相关,有多项研究发现,他们还与白血病细胞的耐药有相关性。因此,我们采用Phospho-flow技术检测初诊儿童白血病细胞磷酸化蛋白即P-AKT、P-ERK1/2和P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6的表达,分析PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/ERKJAK/STAT通路与患儿危险分型、药物治疗反应之间以及急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia ,ALL)高危分型之间的关系,探讨Phospho-flow技术的临床应用价值。目的 1.在本实验室建立流式细胞术检测白血病患儿骨髓或外周血细胞磷酸化信号蛋白的磷酸化流式细胞技术; 2.采用磷酸化流式细胞术检测白血病患儿骨髓或外周血白血病细胞内信号通路磷酸化蛋白的表达,了解儿童白血病细胞内磷酸化蛋白P-ERK1/2、P-AKT、P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5和P-STAT6的表达,分析PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/ERK、JAK/STAT通路与患儿危险分型、药物治疗反应之间以及ALL高危分型之间的关系,探讨Phospho-flow技术的临床应用价值。方法 1.流式细胞术检测K562细胞株的磷酸化蛋白 (1)将P-AKT、P-ERK1/2表达阳性的K562细胞株作为阳性对照细胞,U0126(MEK阻滞剂)和LY294002(PI3K阻滞剂)阻滞的K562细胞作为阴性对照细胞。 (2)细胞内磷酸化蛋白的固定:根据Sue Chow等的Phospho- flow实验方法,采用终浓度为4%的甲醛,在37℃中孵育10min固定细胞。 (3)细胞破膜:①加入1ml含90%甲醇的破膜工作液,将细胞管置于冰中孵育30min(根据BD公司说明书);②加入1ml含50%甲醇的破膜工作液,细胞管置于室温下孵育10min。 (4)加入抗体:每组细胞均分为IgG对照管和磷酸化抗体管: IGG对照管:IgG1- Alexa 488和IgG1-Alexa 647磷酸化抗体管:P-ERK1/2- Alexa 488和P-AKT- Alexa 647各荧光抗体加入20ul,在室温中避光孵育30min,洗涤后上流式细胞术分析 2.流式细胞术检测白血病患儿骨髓白血病细胞的磷酸化蛋白骨髓标本不同处理方法的比较 (1)提取骨髓单个核细胞后固定白血病细胞:使用梯度密度离心法分离单个核细胞后,采用4%的甲醛固定,准备破膜。破膜:每管加入1ml含90%甲醇的破膜工作液,将细胞管置于冰中孵育30min。 (2)固定白血病细胞同时裂解红细胞:取患儿100ul骨髓或全血,每管加入固定\红细胞裂解液1×buffer 2mL,在37℃水浴中10min(根据BD公司试剂说明书);每管加入1ml含90%甲醇的破膜工作液,将细胞管置于冰中孵育30min(根据BD公司说明书)。细胞的荧光抗体标记 (1)加入细胞表面CD抗体,识别幼稚细胞群: B-ALL: CD45-Percp/CD10-FITC/CD19-PE/CD34-APC AML: CD45-Percp/CD13-FITC/CD33-PE /CD34-APC T-ALL:CD45-Percp/CD5-FITC/CD7-PE /CD34-APC (2)细胞内磷酸化抗体标记:对照管:CD45-Percp/IgG1-Alexa 488/IgG1-PE/IgG1-Alexa 647;磷酸化蛋白检测管: CD45Percp/P-ERK1/2-Alexa-488/P-AKT-Alexa 647/CD34-PE或CD45Percp/P-ERK1/2-PE/P-AKT-Alexa 647/CD34-APC (根据每个患者表达CD表达调整磷酸化抗体与CD抗体的组合) 3.流式细胞术分析磷酸化蛋白采用FACSCanto流式细胞仪分析,K562细胞株阳性对照组作为骨髓白血病细胞检测P-AKT、P-ERK1/2的阳性对照细胞,K562细胞株阴性对照组作为P-AKT、P-ERK1/2的阴性对照。根据K562的阳性和阴性对照分析白血病患儿P-AKT、P-ERK1/2是阳性或阴性表达。提取单个核细胞处理方法(骨髓提取单个核细胞后,固定破膜处理细胞方法)的细胞管,在流式细胞仪分析时采用光散射图(FSC/SSC)设门;直接全血方法(固定白血病细胞同时裂解红细胞处理方法)的细胞管,采用CD45/SSC联合设门分析白血病幼稚细胞。两个处理方法在设门后,均同时联合细胞表面CD抗原(CD10、CD34、CD5、CD7、CD33等)分析磷酸化蛋白P-AKT、P-ERK1/2。 4.采用磷酸化流式细胞术检测即P-AKT、P-ERK1/2和P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6 磷酸化流式细胞术细胞处理(直接全血方法):固定白血病同时裂解红细胞:取患儿100 ul骨髓或全血,每管加入固定\红细胞裂解液1×buffer 2ml,将细胞管置于37℃水浴中10min,洗涤。每管加入含1ml 90%甲醇的破膜工作液,将细胞管置于冰中孵育30min。加入CD表面抗体和磷酸化抗体孵育后,流式细胞仪分析。结果 1.流式细胞术检测K562细胞的磷酸化蛋白:K562阳性管可见有P-AKT、P-ERK1/2的阳性表达;U0126(MEK阻滞剂)和LY294002(PI3K阻滞剂)处理的阴性管可见P-AKT、P-ERK1/2无阳性表达。 2.两种破膜方法处理K562细胞的比较: K562细胞采用90%甲醇与50%甲醇破膜处理,P-AKT阳性率分别为(52.5±8.7)%和(36.8±9.3)%,P0.05,差异有统计学意义;其P-ERK1/2的阳性率分别为(45.7±10.7)%和(28.8±12.1)%,P0.05,差异有统计学意义。 3.比较两种细胞处理方法检测骨髓白血病细胞磷酸化蛋白的差异提取单个核细胞处理与固定白血病细胞同时裂解红细胞处理骨髓,检测26例患儿白血病细胞的P-AKT的阳性率分别为46.2%和50.0%(P0.05),两种处理方法无统计学差异。提取单个核细胞处理与固定白血病细胞同时裂解红细胞处理骨髓,检测26例白血病患儿白血病细胞的P-ERK1/2的阳性率分别为30.8%和38.5%(P0.05),两种方法无统计学差异。 4. 9例非M3 AML患儿各磷酸化蛋白的表达:P-AKT为55.5%,P-ERK为44.4%,P-STAT5为33.3%,P-STAT6为55.5%, P-STAT1、P-STAT3均为0.0%。9例患者表达磷酸化蛋白各有差异。 5. 17例B-ALL患儿各磷酸化蛋白的表达:P-AKT阳性率为35.3%;P-ERK1/2阳性率为11.8%;P-STAT1阳性率为0.0%;P-STAT3阳性率为0.0%;P-STAT5阳性率为11.8%;P-STAT6阳性率为17.6%。7例磷酸化蛋白表达阳性的B-ALL患儿中,他们所表达的磷酸化蛋白种类各有差异。3例患儿有1种以上磷酸化蛋白表达,他们表达不同的磷酸化蛋白。 6.15例停药一年以上白血病患儿(对照组)的P-AKT、P-ERK1/2、P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6的表达:均为阴性。 7. ALL患儿P-AKT表达阳性组与阴性组WBC的差异:P-AKT阳性组与阴性组的WBC分别为(157.6±131.2)×10~9/ml和(26.6±19.8)×10~9/ml,P0.05,差异有统计学意义。 8. ALL白血病磷酸化蛋白表达阳性组与阴性组患儿早期治疗反应(D8、D19)之间关系:ALL患儿P-AKT、P-ERK1/2、P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6的表达阳性与阴性在D8天泼尼松诱导试验的敏感性上均无明显差异;在D19天早期诱导治疗反应上均无明显差异。在所检测的6个磷酸化蛋白中,存在2个以上磷酸化蛋白表达阳性的AL患儿与早期治疗反应不佳之间可能存在相关性。 9. ALL白血病磷酸化蛋白表达阳性组与阴性组患儿诱导治疗完全缓解(D33)之间关系:所有ALL在诱导治疗的D33天均完全缓解,在诱导治疗D33天完全缓解率与各磷酸化蛋白表达阳性无相关性。 10. ALL患者各磷酸化蛋白P-AKT、P-ERK1/2、P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6表达阳性与阴性在白血病高危分型之间的关系:B-ALL患儿P-AKT阳性组与阴性组的高危型百分率分别为87.5%和0%,P0.05,差异有统计学意义。P-ERK1/2、P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6阳性组与阴性组的高危型百分率差异均无统计学意义。全文结论 1. 4%的甲醛固定磷酸化蛋白和90%甲醇破膜细胞的流式细胞术方法可用于细胞株和单个细胞悬液的实验研究。 2.固定/裂解红细胞液处理白血病患者PM或BM固定细胞,90%甲醇破膜细胞的流式细胞术方法,可用于白血病信号通路的临床实验研究。 3.我们应用磷酸化流式细胞术对儿童急性白血病的磷酸化信号蛋白进行了初步观察,证实儿童白血病细胞存在AKT、ERK1/2、STAT5和STAT6的激活。 4.白血病细胞信号蛋白P-AKT、P-ERK1/2、STAT5和STAT6的表达,有可能作为白血病的分子标志。P-AKT可能作为白血病高危分型的实验指标之一,有关这些信号蛋白在儿童白血病细胞表达的分子生物学意义与临床应用价值,有待进一步的深入研究。
【图文】：

激酶,通路图,磷酸化,细胞因子

RAF/MEK/ERK通路和JAK/STAT通路也存在相互作用[15](图1)。因此，采用流式细胞术检测初诊患儿白血病细胞存在多个磷酸化信号蛋白激活的患儿可能具有高的耐药性。可能作为患儿高危的危险标志。信号蛋白的分子靶向治疗随着伊马替尼有效治疗BCR-ABL阳性的慢性粒细胞白血病（CML），看到了分子靶向药物在白血病中的治疗应用前景。针对这些信号蛋白靶向治疗的一个优点是，我们不需要知道是哪一种基因突变引起的信号通路激活，只要使用通路抑制剂就可达到治疗的效果。现在抑制信号蛋白持续性激活的分子靶向药物正在基础和临床实验研究中。根据患者激活的信号蛋白类型，选择相应的分子靶向药物进行治疗。有研究发现AKT抑制剂在癌症细胞中可能具有多效性，采用AKT抑制剂可阻断信号转导，起到抗肿瘤效应。Nyakern M等[16]在白血病T细胞的体外试验中证明，派立福辛（AKT抑制剂）与传统的化疗药物依托泊苷联合使用具有协同效应

流式细胞术分析,破膜,流式,白血病细胞

29图3 B-ALL患儿的磷酸化流式图：骨髓经固定/裂解液直接固定白血病细胞和裂解红细胞90%甲醇破膜处理后，流式细胞术分析幼稚细胞P-AKT、P-ERK1/2表达。A:为SSC/CD45图设门幼稚细胞群P1；B：为幼稚细胞群P1的CD34/CD19的表达，可见幼稚有明显的CD34+/CD19+占48%；C、E分别为P-AKT、CD34和P-ERK、CD34的同型阴性对照；D：CD34/P-AKT图，，P-AKT占幼稚细胞的34%，其中CD34+/P-AKT+为18%，CD34-/P-AKT+14%，F ：为CD34/P-ERK1/2 图，可见P-ERK1/2+ 占幼稚细胞的3.6% ，其中CD34+/P-ERK1/2+为2%，CD34-/P-ERK1/2+为1.6%
【学位授予单位】：广州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R733.7

【参考文献】