自噬在新生大鼠支气管肺发育不良中的作用及调控机制研究

发布时间：2020-04-22 18:52

【摘要】：目的:支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早产儿,尤其是极低出生体重儿和超低出生体重儿呼吸系统常见的并发症之一,随着早产儿存活率的改善,BPD的发生率也逐年增高。BPD患儿由于肺部发育障碍常同时伴有一系列的心血管系统及神经系统的并发症,这些并发症可能一直持续至成年。目前尚无治疗BPD安全有效的方法,因此,弄清BPD的发病机制探寻新的治疗方法已经成为新生儿工作者的研究重点。肺泡II型上皮细胞(type II alveolar epithelial cells,AT-Ⅱ)是BPD肺上皮损伤的关键靶细胞,研究发现,其损伤机制涉及膜脂质过氧化、增殖受抑、凋亡过度等。AT-Ⅱ凋亡被认为是BPD肺泡发育不良的关键环节,然而,凋亡作为一种BPD时AT-Ⅱ损伤后的结局,是否还存在其他的调控机制,目前尚不清楚。自噬是广泛存在于哺乳动物神经、呼吸、心血管以及血液等系统中的生物学现象,用于维持细胞内环境的稳定,是发育、老化过程中普遍存在的共同机制,但自噬水平的异常则还可影响细胞凋亡或死亡的过程。为了证实BPD时自噬过程是否出现损伤,损伤的靶点在哪,我们对自噬过程的标记物以及自噬通路中涉及到的其他蛋白进行了检测;为了证实BPD发生发展中自噬的作用,我们予BPD模型新生大鼠应用自噬促进药物或自噬抑制药物,观察肺泡发育情况以及凋亡水平;我们还建立了高氧暴露细胞模型,观察细胞自噬水平改变,并应用自噬干预药物,明确自噬对氧化应激细胞损伤的作用;进一步,我们寻找致BPD自噬水平改变可能的关键蛋白,为探索BPD的新机制,发现新的BPD的治疗手段奠定实验基础。方法:按照我们已建立的方法,100只新生Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为模型组(暴露于O_2,FiO_2 0.8)和对照组(暴露于空气,FiO_2 0.21)。于实验后的1、3、7、14、21天,每组选取10只,透射电镜下观察自噬小体及凋亡小体,TUNEL染色观察凋亡细胞,免疫组化观察LC3B、P62、lamp1及Stx17定位及表达,免疫荧光双染观察LC3B与p180(肺泡II型上皮细胞标志物)共定位及表达,实时定量PCR检测LC3B、P62、Lamp1及St17的mRNA表达水平,Western blot检测LC3B、P62、lamp1、caspase3-cleaved及Stx17蛋白表达水平。将另140只新生SD大鼠分为三组,予新生大鼠体内应用自噬干预剂,每组每个剂量10只鼠。一组给BPD模型大鼠应用雷帕霉素,剂量2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg,隔日一次;第二组予BPD模型大鼠应用氯化锂,剂量20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg,每天一次;第三组,给予正常新生大鼠氯喹,剂量分别为1mg/kg、10mg/kg、20mg/kg,每天一次。每组均设安慰剂组,用法均为腹腔注射,共两周。收集肺组织标本观察肺组织发育情况,及自噬相关蛋白及其mRNA水平。再次选取80只新生SD大鼠,生后建立BPD模型组及对照组,予实验后的3、7天,每组每个时间点20只,按照我们课题组以往的贴壁选择法分离、纯化、培养AT-Ⅱ细胞,并进行LC3B、P62、Lamp1蛋白及mRNA的检测。另外,建立高氧暴露细胞模型,将AT-Ⅱ原代细胞为在FiO_2 0.8孵箱中培养,分别在0h、6h、12h、24h、48小时后收集细胞,并应用自噬干预药物,应用MTT检测细胞存活情况,应用western-blot检测自噬及凋亡相关蛋白水平。结果:1、BPD新生鼠中肺AT-Ⅱ细胞凋亡小体及自噬体的观察。透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)下,模型组7天凋亡细胞增多,并发现凋亡小体与自噬小体共存于同一AT-Ⅱ细胞的现象。进一步观察到,模型组7d可见大量自噬体,较对照组明显增多。2、体内实验,检测BPD新生鼠中肺组织自噬相关蛋白及其mRNA水平的变化。Western-blot结果显示,正常对照组随日龄增长,LC3B-II、p62蛋白表达略增加,7天时明显高于3天时的表达,并伴有相对应的mRNA的增高。模型组LC3B-II蛋白表达7天异常增高,甚至明显高于对照组,14天后开始降低,21天表达最低,低于对照组。模型组P62的蛋白表达7天最高,明显高于对照组,后表达持续较高。Lamp1蛋白表达随高氧暴露时间延长逐渐增高,7天最高,明显高于对照组,后维持在高水平。模型组LC3B、p62、Lamp1蛋白7天时较生后3天水平增高,且明显高于对照组,但不伴有相对应的mRNA的增高。免疫组化及免疫荧光结果显示这几种自噬相关蛋白在肺组织几乎所有细胞均有表达,且为细胞浆染色为主,LC3B染色可以看到模型组7天较对照组阳性细胞明显增多,且呈点状聚集增多;p62和Lamp1均显示7天模型组阳性染色均较对照组明显增多,且为细胞浆染色。LC3B与p180免疫荧光双染可见,LC3B与p180存在共定位于AT-Ⅱ细胞,且7天模型组双染阳性细胞较对照组明显增多。3、BPD新生鼠肺原代AT-Ⅱ细胞自噬相关蛋白及其mRNA的变化。Western-blot结果显示BPD新生鼠肺原代AT-Ⅱ凋亡及自噬水平变化同BPD模型肺组织。LC3B-II及p62蛋白表达7天达高峰,明显高于对照组,Lamp1蛋白表达同样在7天最高,明显高于对照组。三种蛋白的mRNA的表达模型组和对照组间未见明显统计学差异。4、体内实验,应用自噬干预药物后BPD新生鼠中肺组织自噬蛋白水平的变化。Western-blot可见BPD新生鼠应用雷帕霉素(rapamycin,RAPA)或氯化锂(LiCl)后肺组织RAC值增加,肺泡间隔厚度减少,肺组织p62、LC3B-Ⅱ、caspase-3-cleaved蛋白表达降低。正常新生大鼠应用氯喹(CQ)后,出现了BPD类似的表现,RAC降低,肺泡间隔增厚,Western-blot可见p62、LC3B-Ⅱ、Caspase-3-cleaved增加。5、体外实验,原代AT-Ⅱ细胞高氧暴露模型中自噬蛋白水平的变化。Western-blot结果显示随高氧暴露时间延长LC3B-II、p62蛋白逐渐增高,12h最明显,24h、48h逐渐恢复,Stx17在6小时后降低,12小时恢复。6、体外实验,应用自噬干预药物后原代AT-Ⅱ细胞高氧暴露模型细胞活性。MTT实验结果显示应用自噬促进剂雷帕霉素及氯化锂后细胞存活率上升,应用自噬抑制剂3-MA和氯喹后细胞存活率下降。7、体内实验,BPD新生鼠中肺组织Stx17的表达。Western-blot结果显示BPD时Stx17蛋白表达3天开始降低,14天后升高,Rrealtime-PCR结果显示BPD时Stx17mRNA的表达从3天开始较对照组明显降低。8、体外实验,原代AT-Ⅱ细胞高氧暴露模型应用雷帕霉素后Stx17的表达变化。Western-blot结果显示随高氧暴露6h应用雷帕霉素后Stx17的表达较前增加。结论:1、正常新生大鼠在生后早期快速肺发育阶段,LC3B-Ⅱ、p62蛋白水平及基因表达同步增高,提示正常新生大鼠肺组织的发育需要维持稍高的自噬水平。2、在BPD的早期阶段,尽管LC3B-Ⅱ、p62蛋白水平异常增高,但并不伴有对应mRNA的增加,提示这种自噬相关蛋白的增高是降解障碍所致,自噬流受阻可能参与了BPD的发生发展过程。3、在细胞水平验证,BPD时AT-Ⅱ细胞的LC3B-Ⅱ、p62蛋白水平增高并不伴有对应mRNA表达增加,趋势与组织水平相似,提示BPD的发生发展过程中存在AT-Ⅱ细胞自噬过程受损。4、应用自噬促进剂(雷帕霉素、氯化锂)后,自噬水平恢复,LC3B-Ⅱ、p62蛋白水平降低,BPD新生鼠肺泡发育结果明显改善;应用自噬抑制剂(氯喹)后,使自噬流阻断,LC3B-Ⅱ、p62蛋白聚集,正常新生鼠肺泡出现发育障碍,出现类似BPD的肺组织改变。5、分别在组织和细胞水平验证,Stx17减少与BPD自噬过程受损LC3B-Ⅱ、p62蛋白水平增加密切相关,提示Stx17表达降低所致自噬功能受损可能是BPD发生发展的重要机制之一。
【图文】：

透射电镜,肺泡,增厚,对照组

是评价肺泡发育的指标，对照组RAC值随日龄增加逐渐增高，而模型组未见明显改变（14天、21天均p＜0.01）。肺泡间隔厚度随高氧暴露时间延长逐渐增厚（14天、21天均p＜0.01）（图1-1）。图1-1 肺组织形态学的改变（×200倍）。A：模型组，3d肺泡间隔增厚，7d、14d、21d肺泡体积逐渐增大，肺泡数减少，嵴样结构减少，肺泡间隔进一步增厚。B：RAC值正常组逐渐增高，而模型组未见明显改变。C：肺泡间隔厚度模型组逐渐增高。*为同时间点的模型组和对照组差异显著P < 0.05，**为同时间点的模型组和对照组差异显著P < 0.01。3.2 透射电镜下观察细胞超微结构透射电镜可见正常肺泡II型上皮细胞体积较小，呈立方形，表面稍突向肺泡腔。细胞核大而圆

透射电镜,透射电镜观察,自噬体

中国医科大学博士学位论文9糊不清，凋亡细胞可见胞浆中存在凋亡小体（图1-2B），并且仔细观察改凋亡细胞，可见同一细胞中存在多个自噬小体（图1-2C、D）。图1-2 透射电镜观察肺泡II型上皮细胞（×20000倍）A： 7天对照组正常AT-Ⅱ细胞，结构完整，胞浆内可见板层小体结构（LB）及线粒体（Mi）；B：7天模型组大鼠肺AT-Ⅱ可见细胞核染色质凝集，细胞核固缩的凋亡小体（黑色箭头），细胞浆中可见双侧膜结构的自噬小体（白色箭头，放大后见C、D）以及板层小体排除后的囊泡状结构；C、D：B图细胞胞浆中的自噬小体结构放大后可见双层膜结构以及包裹的细胞器。3.3 自噬及其相关指标检测3.3.1 透射电镜观察自噬小体通过透射电镜，我们观察到对照组和模型组中均可见自噬小体。并且，模型组自噬小体数目随高氧暴露时间延长逐渐增多，模型组7d最多，可见大量自噬体，模型14天时自噬体大多排空
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R722.6

【参考文献】