儿童哮喘危险因素和TIM基因多态性研究

发布时间：2020-04-23 01:03

【摘要】：研究背景哮喘是儿童时期最常见的慢性呼吸道变应性疾病，近些年来在全球范围有逐渐增加的趋势[1,2]。大多数成年期哮喘由儿童哮喘发展而来，其病因既受环境因素的影响，又有明显的遗传倾向，是一种复杂的多基因遗传性疾病[3]。 McIntire[4]在小鼠11号染色体上确定了一个可以调节T细胞和气道表型的基因座T细胞和气道表型调节因子Tapr（T cell and airway phenotype regulator）,并在这一座位上发现了一个新的基因T细胞免疫球蛋白粘蛋白域TIM (T cell immunoglobulin domainand mucin domain)基因家族，从此人们揭开了TIM家族的神秘面纱。人类的TIM基因家族有三个即：TIM-1、TIM-3和TIM-4，定位于染色体5q33.2[5-7]，此区域是哮喘的主要遗传易感位点之一。TIM蛋白是TIM基因编码的I型跨膜蛋白，其基本结构包括N末端免疫球蛋白V区(IgV)结构域、黏蛋白样结构域、跨膜区和一个带有磷酸化基序的胞质尾区结构[8]。TIM基因家族在哮喘等变态反应性疾病和自身免疫性疾病的发生发展中起到至关重要的作用[9]。TIM-1是TIM家族第一个被发现也是最重要的一个分子，在非洲绿猴的肾脏细胞中首次被发现[10]。后来被证实与人类甲型肝炎病毒受体humanhepatitis A virus receptor，hHAVcr-1[11]及肾损伤分子1 kidney injury molecule 1,KIM-1[12]为同一分子。TIM-1分子不仅选择性地表达在活化的CD4+T细胞表面尤其是Th2细胞表面，调节Th2型细胞介导的免疫应答[4,6]，还影响巨噬细胞在局部炎症中的作用[13]。而TIM-3分子主要表达在终末期的Th1细胞表面，对Th1细胞起负性调控作用[14,15]。TIM-4是TIM-1的天然配体，专一地表达在巨噬细胞，树突状细胞等抗原体呈细胞表面，与TIM-1结合后刺激Th2细胞的增值和分化[16,17]。因此，人类TIM基因家族在参与Th1/Th2细胞介导的免疫调节中起到关键作用[5]。研究目的调查重庆地区儿童哮喘发病的相关因素，分析TIM-1基因多态性和HAV感染、TIM-4基因多态性与中国西南地区儿童哮喘的关系，为儿童哮喘的特异性预防和治疗提供参考。研究方法 1．以重庆第三军医大学附属西南医院儿科哮喘门诊或儿科病房2007年6月-2010年12月期间哮喘儿童413例，采取数字随机法选取同期来院体检及就诊的非哮喘的儿童420例作为对照。通过问卷调查和做相应检查，追溯哮喘病史并随访其治疗情况，寻找哮喘发病的相关因素。 2．收集2007-2010年在本院儿科门诊及住院部就诊怀疑哮喘的所有儿童，选取均检测SPT、TIgE、外周血EOS水平和肺功能的患儿549例，以[18]2003年中华医学会儿科分会呼吸组制定的儿童哮喘防治常规（试行）以临床标准（临床症状和肺功能）最终确诊358例为哮喘（包括咳嗽变异型哮喘），191例为其他疾病，包括上呼吸道感染、肺炎、湿疹、荨麻疹、慢性咳嗽(非咳嗽变异型哮喘)、过敏性鼻炎、结核等。作出受试者工作特征曲线（ROC曲线），确定诊断截断点（cut off points）TIgE为88IU/ml，EOS为288×106个/L，，为儿童哮喘的诊断提供参考。 3．选取TIM-1外显子4（157insMTTTVP)和启动子区-416GC、-1454GA两个多态性位点和TIM-4基因启动子区的rs6882076和内含子区rs4704727两个位点。选取哮喘组儿童579例,平均年龄7.2岁，对照组儿童524例,平均年龄7.6岁，采用聚合酶链反应检测所有研究对象的TIM-1三个多态性位点和TIM-4两个多态性位点的基因型及等位基因频率，并检测HAV感染状态，进行病例对照研究分层分析。研究结果 1．调查10各相关因素，经非条件logistic回归分析，最终发现6个危险因素,其中家族遗传性、特应性体质、皮肤点刺阳性、总IgE是儿童哮喘的高危因素；2个保护因素：母乳喂养和HAV感染。 2．应用非参数法估计儿童哮喘的3种检验方法曲线下面积：EOS为0.699（95%CI 0.655～0.744），TIgE为0.827（95% CI 0.793～0.862），SPT为0.806（95% CI 0.766～0.847）。检验的灵敏度、特异度、正确率、阳性预测值、阴性预测值，TIgE分别是85.5%、64.7%、77.2%、77.9%、75.9%；SPT分别是87.5%、71.8%、81.6%、83.8%、77.5%；而EOS分别是77.5%、46.8%、61.9%、58.7%、68.1%；TigE＋SPT平行试验验分别是81.4%、75.2%、79.6%、89.1%、61.8%；TIgE+SPT系列试验分别是94.2%、64.1%、79.2%、72.6%、91.6%。 3．哮喘组和对照组HAV暴露的水平研究发现，哮喘组和对照组的HAV水平存在显著性差异，HAV血清阴性组相对于阳性组是发生儿童哮喘的危险因素（OR=5.529，3.850-7.939，P=0.000）。-416GC位点与哮喘易感性相关（P=0.002，OR=1.384，95%CI1.148-1.669),外显子4插入缺失变异和-1454GA位点均与哮喘无相关性。TIM-4内含子区rs4704727位点与哮喘易感性相关(P㩳0.00,OR=1.603,95%CI 1.304-1.971),TIM-4启动子区rs6882076位点与哮喘易感性无相关性。结论通过对儿童哮喘患儿的可疑危险因素的Logistic回归分析,诊断方法的评价和TIM基因家族聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)病例对照研究结果显示: 1、遗传因素与哮喘密切相关,特应性体质是儿童哮喘的危险因素。母乳喂养和HAV感染为儿童哮喘保护因素。 2、TIgE与SPT的灵敏度、特异度、正确率、阳性预测值、阴性预测值相似,且均优于EOS,无论是平行试验还是系列试验TIgE+SPT的组合均优于各组中的其他组合,TIgE+SPT的联合试验对哮喘的诊断意义较大。 3、TIM-1基因-416GC位点与哮喘易感性相关,但与HAV感染水平无关。TIM-4内含子区rs4704727位点与哮喘易感性相关(P㩳0.00,OR=1.603,95%CI 1.304-1.971),TIM-4启动子区rs6882076位点与哮喘易感性无相关性。
【图文】：

ROC曲线,ROC曲线,诊断价值

果秩和检验的 Mann-Whitney统计量相等。本实验RO95% CI 0.655～0.744），TIgE为 0.827（95% CI 0.793 CI 0.766～0.847），对于一个诊断试验，ROC曲线下较低，在0.7～0.9之间时诊断价值中等，在0.9以上时诊诊断价值较低，而TIgE和SPT的诊断价值较高。以TI标准（即≥88IU/ml为阳性，＜88IU/ml为阴性），以E诊断标准（即≥288×106个/L为阳性，＜288×106个/L为IgE、SPT的比较（表 2.1）。并同时计算了三种检查方法T、TIgE、EOS三个实验只要有一个试验阳性，就可以验），只有全部实验均为阳性时才能诊断哮喘。以上实gE、SPT单独和联合检测对哮喘的诊断实验结果评价。正确率、阳性预测值、阴性预测值相似，且均优于EO判断结果一致。无论是平行试验还是系列实验TIgE+SP合，说明TIgE+SPT的联合实验对哮喘的诊断意义较大

电泳图,全基因组,电泳,哮喘

区分哮喘组和对照组的等位基因和基因型之间的统计学差异，并分析哮喘遗传多态性的风险 odds ratios (ORs) and 95% confidence interval（CI）。采用在线 SHEsis 软件（http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）进行两两 SNP 位点的连锁不平衡分析并构建单体型进行病例对照研究。血清总 IgE、EOS 和 SPT 水平在各组之间的差异采用 SPS统计软件中的单因素方差分析进行统计分析. P <0.05 有统计学意义。结果1 SNP 分型结果1.1 全基因组 DNA 电泳结果取全基因组 DNA 20ul 在 1%的琼脂糖凝胶电泳中进行分析，结果发现均跑出较为明亮的单一条带（图 3.1），说明 DNA 提取的量和浓度均达到要求。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R725.6

【参考文献】