咖啡因通过NF-κB下调NLRP3对BPD肺保护作用的研究

发布时间：2020-04-25 16:16

【摘要】：目的:支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早产儿最常见的呼吸系统疾病,目前发病机制尚不明确。新型BPD的主要病理改变是肺泡结构简单化和肺血管发育不良。现有的研究已证实,肺泡二型细胞的损伤和修复失衡是导致BPD肺发育障碍的关键。基因的遗传易感性和炎症、氧化应激、机械通气、早产等多种环境因素相互作用最终可导致肺泡二型上皮细胞的损伤。损伤的肺泡二型上皮细胞出现增殖/凋亡失调,转化障碍甚至坏死,严重影响正常的肺发育进程,最终导致BPD的发生。因此探索BPD的可能发病机制和药物防治有着重大的科研价值和临床意义。炎症在BPD早期和进展中发挥的作用已被公认,大量研究表明,BPD患儿的BALF(Bronchoalveolar Lavage fluid)和血清中的炎症因子表达明显增加,包括IL-1β,IL-6,IL-8,IL-18和TNF-α等。炎症因子的释放能激活固有免疫反应,产生级联反应,进一步调节多种细胞因子、趋化因子和生长因子的分泌,导致肺泡二型上皮细胞损伤与修复失衡,最终形成BPD。以往的研究多局限于炎症因子的表达,而IL-1β和IL-18的成熟和分泌与炎性小体的关系密不可分。炎性小体(inflammasome)由胞浆内模式识别受体(Cytoplasmic internal pattern recognition receptors,PRRs)参与组装,是一种多蛋白复合物,参与固有免疫,在感受和识别病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)或者来自于宿主的危险信号分子模式(Damage associated molecular patterns,DAMPs)后,招募和激活蛋白酶Caspase-1,活化的caspase-1片段对IL-1β和IL-18的前体进行切割,产生成熟的IL-1β和IL-18,促进炎症反应。多种炎症小体中NLRP3的作用最为广泛,参与多种慢性炎症性疾病。有研究报道,NLRP3敲除的转基因小鼠在高氧诱导下的肺发育形态明显优于野生型,这提示NLRP3是影响BPD肺发育的关键因子之一。多种因素参与调控NLRP3,部分研究发现NF-κB在转录水平调控NLRP3,但这种调控是否起主要作用仍需进一步验证。咖啡因作为甲基黄嘌呤类药物,因为药效好,安全性高,半衰期长等特点,既往用于早产儿呼吸暂停的防治,而大量的临床回顾性研究发现,使用咖啡因的早产儿BPD的发生率明显低于未使用咖啡因组,这阐明咖啡因对BPD很好的预防作用,且已经在临床常规应用于早产儿。部分学者在BPD动物模型中也验证了咖啡因对未成熟肺脏的保护作用。但是咖啡因通过何种途径对未成熟肺脏发育过程进行保护,目前机制尚不明确。既往的研究阐明,咖啡因组的早产儿血清和BALF中IL-1β、IL-6、IL-8等炎症因子均显著低于对照组,这提示咖啡因有良好的抗炎作用。因此,本研究在以往建立BPD新生鼠模型基础上,试图从肺形态学、肺血管发育、肺生长因子、肺增殖凋亡水平等多角度证实咖啡因对BPD未成熟肺的保护作用,同时通过mRNA和蛋白测定,探讨咖啡因是否通过抑制NF-κB活性下调NLRP3并抑制其功能,从而为BPD的临床治疗提供更好的靶点。方法:建立BPD新生鼠动物模型,随机分为4组:N组:空气+生理盐水,NC组:空气+咖啡因,H组:模型+生理盐水,HC组:模型+咖啡因,HC和NC组于新生鼠第1天给予咖啡因腹腔注射20mg/kg日1次持续至21天,安慰剂组给予等量生理盐水;模型建立参考既往的造模方法,新生鼠于生后6小时内放入氧箱,持续吸入80-85%的氧气,空气组吸入氧浓度为21%;模型建立第14天各取15只鼠处死,取肺脏,并将剩余H组和HC组的实验对象转至空气中继续饲养,至21天每组动物均处死取肺脏。取右肺下叶置于4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,用于苏木素伊红(HE)染色和免疫组化染色,右肺上叶用于肺湿/干重比值的测量,左肺和剩余右肺冻存于-80℃,用于Real-time PCR和Western blot检测。测定肺湿/干比值,计算RAC值和MLI,通过Weigert染色观察弹性纤维表达和沉积,CD31免疫组织化学染色评价肺微血管发育,Western blot测定生长因子TGF-β1和PDGF的表达以及凋亡蛋白cleaved caspase-3和增殖蛋白PCNA的表达,以上多角度综合论证咖啡因对肺脏的保护作用。应用免疫组化染色阐明肺组织NLRP3的定位和表达,Western Blot和Real-time PCR方法检测NLRP3、caspase-1 p10、IL-1β和IL-18蛋白和mRNA表达水平,相关性分析验证NLRP3相对蛋白表达水平和IL-1β、IL-18的蛋白表达水平的相关性。通过Western Blot检测pNF-κB和p IκBα的蛋白表达水平,并通过相关性分析证实pNF-κB的蛋白表达水平和NLRP3的蛋白水平的相关性。实验数据采用Mean±SD表示,应用SPSS20.0软件对数据进行统计学分析,两组间数值的比较采用独立样本t检验,多组间数据的比较采用单因素方差分析,相关性分析采用Pearson分析,p0.05具有统计学意义。结果:1.肺湿/干比值(W/D)比值测量发现,H组在14天和21天的W/D比值明显高于其他3组,HC组低于H组,但仍高于N组和NC组,提示咖啡因能减轻BPD的肺水肿;2.H组RAC值明显下降,MLI明显升高,较其他3组有显著差异,提示肺泡结构简单化,HC组的RAC值高于H组,MLI值低于H组,于14和21天均有显著差异,但较N组和NC组仍有统计学差异;3.弹性纤维染色提示:N组和NC组的弹性纤维主要沉积在肺泡的次级分隔顶端和支气管壁,H组的弹性纤维在次级分隔沉积明显减少,HC组的弹力纤维沉积较H组好转;4.CD31免疫组化染色发现,H组的CD31染色面积明显低于其他3组,14天和21天均有显著差异,HC组的CD31染色面积高于H组,低于N组和NC组;5.H组cleaved caspase-3蛋白水平明显高于其他组,而PCNA蛋白水平明显低于其他组,HC组的cleaved caspase-3和PCNA的蛋白表达水平与N组和NC组无差异;6.H组生长因子TGF-β1和PDGF蛋白水平高于其他3组;HC组TGF-β1蛋白低于H组,高于N和NC组,PDGF蛋白表达仅低于H组,与N组和NC组无差异;7.NLRP3免疫组化提示,H组NLRP3表达明显高于其他3组,主要在肺泡上皮细胞和巨噬细胞的核周腔表达,HC组与N组和NC组表达无差异;8.Western blot结果表明,H组NLRP3蛋白和caspase-1 p10、IL-1β、IL-18的蛋白表达高于其他3组,HC组各指标蛋白均显著低于H组,和N组,NC组表达无差异;9.mRNA结果显示,NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA表达在H组显著高于其他3组,HC组较H组低,但IL-1β和IL-18均高于N组和NC组;caspase-1的mRNA表达低于N组和NC组;10.Pearson相关性分析表明,肺组织NLRP3蛋白表达水平和IL-1β、IL-18的蛋白表达呈正相关。11.Western blot结果表明,H组pNF-κB的蛋白水平明显高于其他3组,HC组和N组、NC组的蛋白表达无差异,H组和HC组的p IκBα蛋白表达高于N组和NC组;12.Pearson相关性分析表明,肺组织pNF-κB的蛋白表达水平和NLRP3的蛋白表达呈正相关。结论:1.在动物模型上验证了BPD新生鼠生后早期持续应用咖啡因可以改善肺发育不良的结局,这与咖啡因在临床上的肺保护作用一致;2.咖啡因能抑制NLRP3的表达和作用,减轻肺组织的炎症反应;3.咖啡因能抑制NF-κB的核转录活性,进而下调NLRP3。
【图文】：

肺组织,干重,肺泡,比值

图 1.1 各组肺组织湿/干重比值的比较A:各组 14d 肺组织湿/干重比值的比较；B：各组 21d 肺组织湿/干重比值的比较（n=10，**代表和其他 3 组相比，p<0.01；##代表和 N 组、NC 组相比，p<0.01）3.2 肺形态学改变3.2.1 HE 染色和 RAC 值、MLI 测定图 1.2 各组肺组织 HE 染色（400x），可见 N 组和 NC 组肺泡在 14 天次级分隔清晰，肺泡结构规整，大小均匀，肺泡间隔较薄；H 组在 14 天肺泡数目和次级分隔数目均显著减少，肺泡腔增大，间隔增厚，可见少许炎症细胞浸润；HC 组肺泡数目较 H 组增多，间隔未见明显增厚。21 天 N 组和 NC 组肺泡数目较 14 天增多，次级分隔数目增加，肺泡发育正常，H 组尽管于 14 天后转至空气，但肺发育仍落后于其他 3 组，HC 组肺泡数目较 H 组增多，间隔略增厚。

肺组织,HE染色,肺泡,数目

图 1.1 各组肺组织湿/干重比值的比较A:各组 14d 肺组织湿/干重比值的比较；B：各组 21d 肺组织湿/干重比值的比较（n=10，**代表和其他 3 组相比，p<0.01；##代表和 N 组、NC 组相比，p<0.01）3.2 肺形态学改变3.2.1 HE 染色和 RAC 值、MLI 测定图 1.2 各组肺组织 HE 染色（400x），可见 N 组和 NC 组肺泡在 14 天次级分隔清晰，肺泡结构规整，大小均匀，肺泡间隔较薄；H 组在 14 天肺泡数目和次级分隔数目均显著减少，肺泡腔增大，间隔增厚，可见少许炎症细胞浸润；HC 组肺泡数目较 H 组增多，间隔未见明显增厚。21 天 N 组和 NC 组肺泡数目较 14 天增多，次级分隔数目增加，肺泡发育正常，H 组尽管于 14 天后转至空气，，但肺发育仍落后于其他 3 组，HC 组肺泡数目较 H 组增多，间隔略增厚。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.6

【相似文献】